多沙唑嗪对映体在动物心血管系统的手性药理学研究

摘要

多沙唑嗪(doxazosin，DOX)是一种喹唑啉类的长效选择性α1受体阻滞剂，是治疗良性前列腺增生(BPH)所致下尿路症状的一线用药[1]，同时可扩张容量及阻力血管，具有良好的降压作用。但是，在抗高血压和降脂治疗预防心肌梗死的大规模临床试验(Antihypertensiveandlipid-loweringtreatmenttopreventheartattacktrial，ALLHAT)中，多沙唑嗪组出现了较多的心血管事件而提前退出了临床试验[2]。为了降低多沙唑嗪的不良反应，人们着手对其手性对映体进行研究。阿夫唑嗪（alfuzosin，ALF）与DOX同属喹唑啉类高选择性α1受体阻断药，DOX及ALF的分子结构中均存在一个手性碳原子，因此，DOX和ALF分别存在(-)DOX、(+)DOX、(-)ALF和(+)ALF四个对映体，临床应用二者的消旋体[（±）DOX和（±）ALF]。目前关于（±）DOX和（±）ALF及其对映体对离体心脏的作用尚不甚清楚。一般认为，心功能受损时导致激素与促炎细胞因子分泌水平可反应心脏收缩功能。脑利钠肽(BNP)、核因子-κB(NF-κB)及白细胞介素-6（IL-6）均是心力衰竭发生的生物学标志物。本研究采用小鼠离体心房组织，观察（±）DOX、（±）ALF及其对映体对心肌收缩力和心率的影响;并观察了长期给予多沙唑嗪及其对映体对大鼠血浆氨基末端原脑利钠肽(NT-proBNP)、NF-κB及IL-6水平的不同影响。
　　 多种信号途径可能参与药物诱发的心肌收缩力改变，为进一步探讨DOX及其光学异构体对心肌收缩力不同影响的机制，本研究使用大鼠离体心房肌标本，研究了酚苄明、阿托品及普萘洛尔、吲哚美辛、维拉帕米、亚甲蓝、H-89等不同阻断剂对多沙唑嗪对映体引起大鼠张力反应的影响。
　　 血浆蛋白结合在药物治疗中起着重要的作用。药物与血浆蛋白结合的变化显著地影响它的药代动力学和药效学。因为对映体之间的蛋白结合率往往造成它们药代动力学的差异。对映体蛋白结合的立体选择性的研究对于理解其药理学、临床疗效及安全性是必不可少的。因此，有必要对生理条件下多沙唑嗪对映体的立体选择性进行研究。本研究采用手性固定相柱联合平衡透析法同时测定大鼠、狗和人血浆中加入消旋多沙唑嗪后其每一对映体的蛋白结合率。结果表明，多沙唑嗪对映体对大鼠，狗和人类血浆蛋白结合具有立体选择性，且种属间也存在差异。
　　 第一部分，多沙唑嗪对映体对心率、心肌收缩力及心衰生物学标志物的影响
　　 本研究采用小鼠离体心房组织，观察（±）DOX及其两种对映体、（±）ALF及其两种对映体对小鼠离体心房心肌收缩力和心率的影响;并观察多沙唑嗪及其对映体长期给药对大鼠血浆氨基末端原脑利钠肽(NT-proBNP)、IL-6及NF-κB水平的不同影响，以期为喹唑啉类α1受体阻断药的临床安全用药和新药设计提供实验数据。
　　 1、(±)DOX和（±）ALF及二者的对映体诱发小鼠离体右心房停搏反应
　　 (+)DOX组的16例标本中，加入30μmol·L-1药物后，5例发生停搏反应;停搏率为31.3％。（±）DOX组和(-)DOX组分别在10μmol·L-1和30μmol·L-1浓度时，各有一例发生停搏反应。(-)ALF、(+)ALF、（±）ALF组和溶剂对照组，未发生停搏反应。
　　 2、(±)DOX和（±）ALF及二者的对映体对小鼠离体右心房心率的影响
　　 各组离体右心房心率的药前值相同(P＞0.05)，溶剂对小鼠离体右心房心率无显著影响（P＞0.05）。(+)DOX和（±）DOX各浓度均显著减慢小鼠右心房心率(P＜0.01)，并具有浓度依赖关系;30μmol·L-1的(+)DOX和（±）DOX组小鼠心率减慢率分别为（83.47±12.23）％和（74.97±15.66）％，3μmol·L-1(+)DOX减慢心率的作用显著强于同浓度（±）DOX(P＜0.01)。(-)DOX（3μmol·L-1）对离体右心房心率无显著影响(P＞0.05)，且(-)DOX在10和30μmol·L-1浓度时减慢心率的作用显著弱于同浓度(+)DOX(P＜0.01)。(-)ALF和(+)ALF（10和30μmol·L-1）显著减慢小鼠心率，30μmol·L-1时小鼠心率分别减慢（13.05±7.27）％和（14.27±9.75）％;（±）ALF仅在30μmol·L-1浓度显著减慢小鼠心率，三者抑制心率的作用强度相同。
　　 3、(±)DOX和（±）ALF及二者的对映体对小鼠离体左心房收缩力的影响
　　 各组左心房心肌收缩力的药前值相同(P＞0.05)，溶剂对小鼠离体左心房心肌收缩力无显著影响(P＞0.05)。(±)DOX和(-)DOX(3、10和30μmol·L-1)显著增强小鼠离体左心房心肌收缩力(P＜0.05)，并具有浓度依赖关系;(-)DOX（10和30μmol·L-1）的正性肌力作用显著强于同浓度（±）DOX的作用(P＜0.05)。相反，(+)DOX具有轻度但显著的负性肌力作用(P＜0.05)。（±）ALF及其对映体（3、10和30μmol·L-1）对小鼠离体左心房心肌收缩力无显著影响(P＞0.05)。
　　 4、(-)DOX、(+)DOX及（±）DOX长期给药对大鼠血浆NT-proBNP浓度的影响
　　 溶剂对照组、(-)DOX组、(+)DOX组及（±）DOX组血浆NT-proBNP浓度分别为475.55±150.21ng·L-1、635.00±343.52ng·L-1、375.55±127.09ng·L-1及424.12±134.19ng·L-1。(+)DOX组及（±）DOX组血浆NT-proBNP浓度低于对照组，但组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。(-)DOX组血浆NT-proBNP值高于对照组，但组间比较差异亦无统计学意义(P＞0.05)。(-)DOX组血浆NT-proBNP浓度高于(+)DOX组(P＜0.05)。
　　 5、(-)DOX、(+)DOX及（±）DOX长期给药对大鼠血浆NF-κB浓度的影响
　　 溶剂对照组、(-)DOX组、(+)DOX组及（±）DOX组血浆NF-κB浓度分别为888.46±343.36ng·L-1、705.77±193.34ng·L-1、1140.00±365.26ng·L-1及910.38±276.39ng·L-1。(+)DOX组及（±）DOX组血浆NF-κB浓度高于溶剂对照组，但组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。(-)DOX组血浆NF-κB浓度高于溶剂对照组，但组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。(-)DOX组血浆NF-κB值低于(+)DOX组(P＜0.05)。
　　 6、(-)DOX、(+)DOX及（±）DOX长期给药对大鼠血浆IL-6浓度的影响
　　 溶剂对照组、(-)DOX组、(+)DOX组及（±）DOX组血浆IL-6浓度分别为48.81±23.39ng·L-1、75.13±21.58ng·L-1、59.44±23.17ng·L-1及70.19±37.44ng·L-1。单因素方差分析结果显示:与溶剂对照组比较，各药物组大鼠血浆IL-6水平无统计学意义(P＞0.05)。
　　 研究结果表明，DOX对小鼠离体心房的心率和心肌收缩力具有明显的影响，高浓度尚可诱发心脏停博反应;DOX的手性结构对其上述活性具有明显的影响。相反，ALF仅轻度抑制小鼠心率，ALF的手性结构对其心脏效应无明显影响。长期灌胃给予DOX及其对映体未显著影响大鼠心衰生物学标志物NT-proBNP及IL-6的血浆浓度;但是，(+)DOX组大鼠的血浆NF-κB水平显著高于(-)DOX组，提示(+)DOX对机体免疫及炎症反应有一定的影响。
　　 第二部分，多沙唑嗪对映体诱发大鼠心房肌收缩力变化的作用机制
　　 本研究采用大鼠离体心房组织研究了酚苄明、阿托品及普萘洛尔、吲哚美辛、维拉帕米、亚甲蓝、H-89等不同阻断剂对多沙唑嗪对映体引起大鼠张力反应的影响。
　　 1、(-)DOX、(+)DOX对离体大鼠左心房心肌张力的影响
　　 溶剂对大鼠心肌张力无显著影响;(-)DOX显著增强大鼠左心房心肌收缩力，3、10、30μmol·L-1的(-)DOX增强大鼠心肌收缩力的百分比分别为(5.57±20.95)、(6.96±39.77)％、(67.46±30.09)％。(+)DOX显著抑制大鼠左心房心肌收缩力，3、10、30μmol·L-1的(+)DOX抑制大鼠心肌收缩力的百分比分别为(-15.61±14.15)％、(-36.99-±23.58)％、(-57.48±56.01)％。
　　 2、阿托品及普萘洛尔对DOX对映体改变大鼠心房收缩力的影响
　　 以阿托品及普萘洛尔预处理标本后，溶剂对大鼠心肌张力无显著影响。(-)DOX显著增强大鼠左心房心肌收缩力），3、10、30μmol·L-1的(-)DOX增强大鼠心房收缩力的百分比分别为（13.02±16.66）％、（53.65±41.02）％、（70.87±52.66）％。(+)DOX显著抑制大鼠左心房心肌收缩力，(+)DOX抑制大鼠心房收缩力的百分比分别为(-8.02±21.43)％、(-21.60±21.50)％、(-63.75±24.14)％。
　　 3、酚苄明对DOX对映体改变大鼠心房收缩力的影响
　　 以酚苄明预处理标本后，溶剂对大鼠心肌张力无显著影响。(-)DOX显著增强大鼠左心房心肌收缩力，3、10、30μmol·L-1的(-)DOX增强大鼠心房收缩力的百分比分别为(13.71±14.39)％、(35.48±11.90)％、（71.62±37.20）％。(+)DOX显著抑制大鼠左心房心肌收缩力，3、10、30μmol·L-1的(+)DOX抑制大鼠心房收缩力的百分比分别为(-14.08±23.48)％、(-33.08±17.85)％、(-60.73±17.21)％。以乙醇预处理标本后，溶剂对大鼠心肌张力无显著影响。(-)DOX显著增强大鼠左心房心肌收缩力，3、10、30μmol·L-1(-)DOX对增强大鼠心房收缩力的百分比分别为（19.05±7.14）％、（49.27±28.71）％、（71.21±35.57）％。(+)DOX显著抑制大鼠左心房心肌收缩力，(+)DOX抑制大鼠心房收缩力的百分比分别为（-10.40±14.76）％、(-23.73±26.18)％、(-65.63±6.52)％。
　　 4、吲哚美辛对DOX对映体改变大鼠心房收缩力的影响
　　 以吲哚美辛预处理标本后，溶剂对大鼠心肌张力无显著影响。(-)DOX显著增强大鼠左心房心肌收缩力，3、10、30μmol·L-1的(-)DOX增强大鼠张力的百分比分别为(19.87±13.06)％、(55.73±18.00)％、（60.25±35.25）％。(+)DOX显著抑制大鼠左心房心肌收缩力，3、10、30μmol·L-1的(+)DOX抑制大鼠心房收缩力的百分比分别为（-7.23±13.39）％、（-31.33±18.74）％、（-70.42±8.90）％。以乙醇预处理标本后，(-)DOX显著增强大鼠左心房心肌收缩力，(-)DOX对大鼠张力的增强率为(21.01±9.75)％、(43.88±28.26)％、(59.45±24.87)％。(+)DOX显著抑制大鼠左心房心肌收缩力，(+)DOX抑制大鼠心房收缩力的百分比分别为(-15.21±13.14)％、(-29.28±23.55)％、(-66.55±6.13)％。
　　 5、维拉帕米对DOX对映体改变大鼠心房收缩力的影响
　　 以维拉帕米预处理标本后，溶剂对大鼠心肌张力无显著影响。(-)DOX显著增强大鼠左心房心肌收缩力，3、10、30μmol·L-1的(-)DOX增强大鼠张力的百分比分别为(24.81±20.49)％、(75.98±23.00)％、（131.15±17.56）％。(+)DOX显著抑制大鼠左心房心肌收缩力，(+)DOX抑制大鼠心房收缩力的百分比分别为（-9.60±17.19）％、(-33.47±9.43)％、(-72.23±14.65)％。
　　 6、亚甲蓝对DOX对映体改变大鼠心房收缩力的影响
　　 以亚甲蓝预处理标本后，溶剂对大鼠心肌张力无显著影响。(-)DOX显著增强大鼠左心房心肌收缩力，3、10、30μmol·L-1的(-)DOX增强大鼠张力的百分比分别为（36.26±9.82）％、（65.99±26.27）％、（16.02±35.33）％。3、10、30μmol·L-1的(+)DOX抑制大鼠心房收缩力的百分比分别为（-5.57±17.32）％、（-10.54±25.09）％、(-58.27±15.47)％。
　　 7、H-89对DOX对映体改变大鼠心房收缩力的影响
　　 以H-89预处理标本后，溶剂对大鼠心肌张力无显著影响。(-)DOX显著增强大鼠左心房心肌收缩力，3、10、30μmol·L-1的(-)DOX增强大鼠心肌张力的百分比分别为(28.96±9.49)％、(81.93±20.75)％、(101.53±51.95)％。(+)DOX显著抑制大鼠左心房心肌收缩力，(+)DOX抑制大鼠心房收缩力的百分比分别为（-17.71±16.37）％、(-30.76±18.38)％、(-67.67±10.74)％。
　　 研究结果表明，(-)DOX增强大鼠心房肌收缩力的作用，可能与心肌α受体、M胆碱受体、β受体以及环氧合酶无关;L型Ca2+通道、细胞内cGMP以及PKA可能在某种程度上参与了(-)DOX在大鼠左心房的正性肌力作用。但是，心肌α受体、M胆碱受体、β受体、Ca2+通道、环氧合酶、cGMP及PKA，可能未参与(+)DOX对大鼠左心房的负性肌力作用。
　　 第三部分，多沙唑嗪对映体在大鼠、犬和人血浆中的蛋白结合率研究
　　 血浆蛋白结合在药物治疗中起着重要的作用。药物与血浆蛋白结合的变化显著影响其药代动力学和药效学。对映体蛋白结合率的不同往往是它们药代动力学差异的原因之一。对映体蛋白结合的立体选择性研究是明确其药理学效应、临床疗效及安全性必不可少的内容。因此，有必要对多沙唑嗪对映体蛋白结合的立体选择性进行研究。本研究采用平衡透析法利用卵粘蛋白手性色谱柱同时测定大鼠、犬和人血浆中多沙唑嗪对映体的浓度，并计算其蛋白结合率。
　　 1、高效液相色谱法的方法学验证
　　 采用高效液相色谱法手性分离血浆及PBS中的（±）DOX，专属性良好，内标（哌唑嗪）、(-)DOX和(+)DOX达到基线分离，最低检测限为0.2ng·mL-1(S/N≥3)。多沙唑嗪对映体在血浆、PBS中的浓度范围分别是50～1600ng·mL-1、12.5～200ng·mL-1，在上述浓度范围内，多沙唑嗪对映体的浓度与峰面积呈良好的线性关系(r＞0.9990)。多沙唑嗪对映体在血浆和PBS的日内、日间精密度分别小于3.2％、6.3％，回收率为90.5％～102.4％，实验过程中稳定性良好。
　　 2、平衡透析条件的优化
　　 在PBS中加入800ng·mL-1的消旋多沙唑嗪，与混合人血浆进行平衡透析，分别在0、4、8、15及20h取样分析。试验表明，37℃时，(-)DOX和(+)DOX迅速通过半透膜，在15h内达到稳态水平。犬与大鼠的血浆平衡时间与人血浆相近。
　　 3、不同对映体间蛋白结合的差异
　　 消旋多沙唑嗪的浓度在200～800ng·mL-1时，(-)DOX在三个不同种属血浆中的蛋白结合率为89.4％～94.3％，(+)DOX为90.9％～95.4％。结果显示，无论(-)DOX还是(+)DOX的血浆蛋白结合率均较高，与之前（±）DOX的研究结果一致。在三种血浆中，加入不同浓度的消旋多沙唑嗪，(-)DOX的结合浓度(Cb)均大于(+)DOX的Cb（P＜0.05），并且这种差异随多沙唑嗪浓度的增加而变得更加明显。这种立体选择性在犬血浆中比在人或鼠血浆中更为明显。犬血浆在含200、400、800ng·mL-1(±)DOX的PBS中，(-)DOX与(+)DOX的Cb均值分别为200.0vs243.0、398.6vs477.3、845.1vs1006.8。因此，在人、犬、鼠的血浆中多沙唑嗪对映体的蛋白结合力均体现了立体选择性，(+)DOX的蛋白结合力均高于(-)DOX。
　　 两对映体蛋白结合能力的不同可能会导致其药物代谢动力学的差异，药物的清除与其在血浆中的游离浓度有直接的关系。(+)DOX的蛋白结合力高于(-)DOX，因此应用消旋多沙唑嗪后人血浆中(-)DOX的非结合态浓度高于(+)DOX，可能是文献报道的人服用（±）DOX后血浆中(-)DOX浓度低于(+)DOX浓度的原因之一。事实上，我们将（±）DOX分别给予犬和鼠后，(-)DOX的浓度也低于(+)DOX的浓度。因此，(-)DOX和(+)DOX间血浆蛋白结合能力的不同可能是人、犬、鼠三个种属中二者药代动力学不同的原因之一。
　　 4、多沙唑嗪蛋白结合率的种属差异
　　 加入200ng·mL-1(±)DOX时，三个种属蛋白结合率差别无统计学意义。而在加入（±）DOX的浓度为400和800ng·mL-1时，犬血浆蛋白结合率小于人的血浆蛋白结合率(P＜0.05和P＜0.01)，此结果与以往报道的人血浆蛋白结合率高于犬一致。由于人、犬、鼠三种混和血浆的血浆蛋白浓度不同（分别为61.81、51.35和57.75mg·mL-1），所以血浆蛋白结合率的值应该用血浆蛋白的浓度进行校正。校正后，多沙唑嗪对映体的蛋白结合率存在种属差异，其顺序为犬＞人＞鼠(P＜0.01)。
　　 以上研究结果表明，在人、犬、鼠的血浆中(+)DOX的蛋白结合力均高于(-)DOX;多沙唑嗪对映体的血浆蛋白结合力在三种血浆中均存在立体选择性;多沙唑嗪对映体的蛋白结合率具有种属差异，其顺序为犬＞人＞鼠。
　　 结论:
　　 DOX对小鼠离体心房的心率和心肌收缩力具有明显的影响，高浓度尚可诱发心脏停博反应;DOX的手性结构对其上述活性具有明显的影响。相反，ALF仅轻度抑制小鼠心率，ALF的手性结构对其心脏效应无明显影响。长期灌胃给予DOX及其对映体未显著影响大鼠心衰生物学标志物NT-proBNP及IL-6的血浆浓度;但是，(+)DOX组大鼠的血浆NF-κB水平显著高于(-)DOX组，提示(+)DOX对机体免疫及炎症反应有一定的影响。
　　 (-)DOX增强大鼠心房肌收缩力的作用，可能与心肌α受体、M胆碱受体、β受体以及环氧合酶无关;L型Ca2+通道、细胞内cGMP以及PKA可能在某种程度上参与了(-)DOX在大鼠左心房的正性肌力作用。但是，心肌α受体、M胆碱受体、β受体、Ca2+通道、环氧合酶、cGMP及PKA，可能未参与(+)DOX对大鼠左心房的负性肌力作用。
　　 在人、犬、鼠的血浆中多沙唑嗪对映体的蛋白结合力均体现了立体选择性，在所有三个种属中(+)DOX的蛋白结合力均高于(-)DOX。多沙唑嗪对映体的蛋白结合率存在种属差异。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 多沙唑嗪对映体对心率、心肌收缩力及心衰生物学标志物妁影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 多沙唑嗪对映体诱发大鼠心房肌收缩力变化的作用机制

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 多沙唑嗪对映体在大鼠、犬和人血浆中的蛋白结合率研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 多沙唑嗪及其对映体的药理学研究进展

致谢

个人简历