siRNA抑制ZNF139前后人胃癌原位移植祼鼠血清差异蛋白质的筛选与鉴定

摘要

目的:以胃癌SGC7901细胞原位移植裸鼠模型为对象，通过荧光双向差异凝胶电泳(2D-DIGE)结合液质联用(LC-MS)鉴定技术等蛋白质组学方法研究抑制ZNF139后对胃癌原位移植裸鼠血清的影响，为ZNF139参与胃癌进展并发现新的肿瘤标志物提供依据。
　　 方法:
　　 1.培养人胃癌细胞株SGC7901，针对ZNF139基因设计siRNA，构建siRNA-ZNF139表达质粒。通过X-tremeGENEHP转染试剂介导转染胃癌细胞株SGC7901，并通过qRT-PCR检测细胞中ZNF139mRNA的相对表达量，计算其抑制效率。
　　 2.以siRNA-ZNF139质粒和阴性对照质粒转染胃癌细胞SGC7901，G418筛选出稳定转染细胞和普通的SGC7901细胞分别注入裸鼠皮下。每4天测量皮下瘤长短径，待皮下瘤直径约1.0cm左右时取出，剪成大小约1mm3瘤块进行鼠间传代，将第六代皮下瘤应用OB生物胶粘贴法进行原位移植。
　　 3.用血清白蛋白/免疫球蛋白清除试剂盒去除胃癌原位移植裸鼠血清中高丰度蛋白，利用SDS-PAGE检测去除高丰度蛋白前后蛋白的完整性及血清蛋白的变化。
　　 4.采用2D-DIGE技术分离siRNA-ZNF139干扰前后胃癌原位移植裸鼠血清蛋白。应用DeCyderDifferentialAnalysisSoftware选取差异明显的蛋白点并利用Ettanspotpicker挖取胶中的差异蛋白点，胶内酶解后利用LC-MS进行分析。再应用BioWorks软件中的SEQUEST运算方法进行数据库检索。
　　 5.将已鉴定的部分差异蛋白通过蛋白质印记(Westernblot)从蛋白质水平进行验证，检测是否与蛋白质组学结果一致。
　　 结果:
　　 1.不同浓度siRNA-ZNF139质粒转染胃癌SGC7901细胞后ZNF139mRNA表达的变化
　　 qRT-PCR检测显示在0μg/ml、0.4μg/ml、0.6μg/ml、0.8μg/ml、1.0μg/ml重组质粒转染的胃癌SGC7901细胞中ZNF139mRNA相对表达量分别为1.003±0.0970,0.7517±0.0436,0.3611±0.0445,0.1622±0.0181,0.5531±0.0377，统计分析显示与0μg/ml组相比各组有显著差异（P＜0.05），其中以0.8μg/ml组抑制效率最高，为83.83％。
　　 2.siRNA抑制ZNF139对裸鼠皮下瘤生长的影响
　　 接种胃癌细胞SGC7901六天后空白组和阴性组裸鼠均长出皮下瘤，十天后实验组裸鼠可见皮下瘤，之后瘤体不断增大。统计学分析表明空白组皮下瘤体积比阴性组略大，差异没有统计学意义（P＞0.05），siRNA-ZNF139组皮下瘤体积明显小于阴性对照组，差异有统计学意义(P＜0.05）。
　　 3.胃癌原位移植裸鼠模型的形态观察
　　 阴性组1只裸鼠因麻醉过量死亡，空白组和siRNA-ZNF139组各1只裸鼠于术后2天死亡，接种2周后15只存活裸鼠上腹部均可触及明显肿块，之后肿块不断增大。空白组原位瘤体积比阴性组略大，差异没有统计学意义(P＞0.05)，siRNA-ZNF139组裸鼠瘤体体积明显小于阴性组，差异有统计学意义(P＜0.05)。原位移植瘤经HE染色组织病理学检查均可见核大深染的肿瘤细胞，证实为胃癌，原位成瘤率100％。
　　 4.血清蛋白完整性检测及纯化
　　 SDS-PAGE分离血清蛋白后经考马斯亮蓝染色显示各组血清蛋白无明显降解，用血清白蛋白/免疫球蛋白清除试剂盒处理后的裸鼠血清中高丰度蛋白含量明显降低，低丰度蛋白条带更明显。
　　 5.siRNA抑制ZNF139前后胃癌原位移植裸鼠血清差异蛋白的筛选与鉴定
　　 在2D-DIGE图谱上分离到的蛋白质点平均为4487±46个，匹配率为83.1％，说明双向电泳技术分离血清蛋白质组可得到较高的重复性。应用DeCyderDifferentialAnalysisSoftware选取7个差异明显的蛋白点。结合LC-MS鉴定出5种蛋白质（APOE、KNG1、α2-MG、mTERF、DIXDCl），其中APOE、KNG1在siRNA-ZNF139组的胃癌血清中表达下调，α2-MG、mTERF、DIXDC1表达上调。
　　 6.siRNA抑制ZNF139对胃癌原位移植裸鼠血清中APOE、KNG1、mTERF、ZNF139蛋白表达的影响
　　 应用Westernblot法对各实验裸鼠血清中APOE、KNG1、mTERF和ZNF139的表达进行了验证。统计学分析表明空白组与阴性组的APOE、KNG1、mTERF和ZNF139的表达量的差异无统计学意义(P＞0.05)，与两对照组相比，siRNA-ZNF139组的APOE、KNG1和ZNF139的表达量显著降低，而mTERF的表达量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），与蛋白质组学结果一致。
　　 结论:
　　 1.siRNA-ZNF139质粒可高效抑制ZNF139基因的表达。
　　 2.siRNA-ZNF139质粒可抑制胃癌裸鼠皮下瘤及原位移植瘤的生长。
　　 3.改良后的组织块OB生物胶粘贴法建立的人胃癌裸鼠原位移植模型可近似模拟胃癌在人体内的增殖、侵袭、转移等生物学行为，而且操作简单、成瘤率高，便于观察、测量和干预，可作为目前较理想的研究胃癌的实验模型。
　　 4.去除血清中白蛋白和免疫球蛋白等高丰度蛋白为血清蛋白质组学研究奠定了基础。
　　 5.DIGE技术具有较高的准确性、重复性和灵敏度，结合LC-MS能准确对差异蛋白质进行筛选鉴定。
　　 6.ZNF139作为转录水平的调控因子，在胃癌中的表达可能通过促进APOE、KNG1和抑制mTERF的表达来促进肿瘤的发生发展。

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