富氢盐水通过失活RaS-ERK1/2-MEK1/2和Akt通路及抑制ROS减轻血管平滑肌细胞的增殖及大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜的增生

摘要

冠状动脉介入治疗(PCI)对于冠状动脉粥样硬化性心脏病具有划时代的意义。但是，即便是应用了药物洗脱支架，仍有5-10％的再狭窄率。
　　 血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)在血管损伤因素刺激下进行增殖和迁移，是动脉粥样硬化和血管再狭窄等血管重塑性疾病的细胞病理学基础。
　　 活性氧(ROS)和氧化应激涉及到动脉粥样硬化和再狭窄的病理生理过程，氢气是一种潜在的抗氧化剂，能清除中和自由基(如·OH和ONOO-)，大量的临床和实验研究证实氢气是一个清道夫，选择性地中和ROS并行使着潜在的细胞保护功能。至关重要的是到目前为止氢气行使这些效能的确切机制还不十分明了。除了其抗氧化效能，有一些特殊通路可能参与其作用机制。
　　 为了阐明富氢介质对血管平滑肌细胞增殖和迁移作用及其分子机制，本文在系统研究富氢介质对VSMC增殖、迁移、细胞周期、细胞凋亡、氧化应激等影响的基础上，进一步探讨其对涉及血管平滑肌细胞增殖迁移通路的影响，另外在大体上，制作大鼠颈动脉球囊损伤的模型来模拟PTCA的过程，观察富氢盐水对新生内膜增殖的影响并探讨可能的机制。实验结果如下:
　　 1、富氢介质通过失活Ras-ERK1/2-MEK1/2和Akt通路及抑制ROS减轻血管平滑肌细胞的的增殖
　　 本部分实验在系统研究富氢介质对VSMC增殖、迁移、细胞周期、细胞凋亡、氧化应激等影响的基础上，进一步探讨其对涉及血管平滑肌细胞增殖迁移通路的影响。实验结果如下:
　　 1.1、氢气对VSMC增殖活力的影响
　　 我们完成MTT实验来评估氢气对平滑肌细胞增殖活性的抑制效果，结果显示，氢气干预组平滑肌细胞的增殖活性比对照组明显下降(32.4±5.2％vs73.3±5.1％,p＜0.01)。
　　 为了评估氢气对血管平滑肌细胞增殖活性的影响是否具有可逆性，氢气干预组培养48小时后去除氢气继续培养至96小时，培养结束后再检测细胞的增殖活性，结果显示，氢气对细胞增殖活性的抑制是可逆的，去除氢气后，血管平滑肌细胞的增殖活性又恢复，这些结果显示氢气行使对平滑肌细胞增殖活性的抑制作用不具有细胞毒性作用。
　　 氢气对平滑肌细胞增殖活性的作用也用BrdU实验进行分析，结果显示，没有氢气干预的平滑肌细胞的BrdU值是(64.1±11.1)％，经氢气干预后，BrdU值是(26.7±4.9)％，显示氢气明显抑制血管平滑肌细胞的增殖活性，并有明显的时效性。
　　 氢气对血管平滑肌细胞增殖的抑制效果进一步被细胞计数所证实，结果显示在48h和72h和对照组(仅用FBS处理的血管平滑肌细胞)相比，用富氢介质孵育的细胞数分别有40％和51％的下降。(P＜0.01)。
　　 1.2、富氢介质对VSMC迁移活性的影响
　　 富氢介质对FBS诱导的血管平滑肌细胞的迁移活性的抑制效果用伤口愈合实验证实，结果显示，用FBS处理24h后的增加的迁移血管平滑肌细胞数为(58.3±13.9)，而同时用富氢介质干预后，其迁移细胞显著下降(18.6±5.8),P＜0.01。
　　 1.3、富氢介质阻止细胞周期进入S期
　　 富氢介质对细胞周期的影响用流式细胞仪测定。通过24h血清饥饿法使细胞处于静止期，78.6±1.4％的细胞处于G0/G1期，10.4±0.2％处于S期，通过10％FBS的诱导使静止的血管平滑肌细胞进入S期，处于G0/G1期的细胞显著降低(51.9±0.9)％，用富氢介质处理后显示抑制了由FBS所诱导的G1-S的进入，结果显示处于G0/G1期的细胞为(68.8±2.2)％，而处于S期的细胞为(16.7±2.0)％，这些结果显示富氢介质阻止细胞周期进入S期。
　　 1.4、富氢介质的抗增殖效果是通过抑制Ras-MEK1/2-ERK1/2通路而实现的
　　 为了研究富氢介质抗增殖效果的机制，用蛋白印迹分析Ras的活性，结果显示，10％FBS诱导Ras快速地激活，用富氢介质处理后显示其可以轻微抑制由FBS诱导的Ras的激活。
　　 磷酸化的MEK1/2和ERK1/2是Ras的下游激酶，在本实验中也被研究，结果显示，富氢介质显著地降低由FBS所诱导的磷酸化MEK1/2的活性;数据也显示FBS也可以诱导磷酸化ERK1/2的激活，在应用富氢介质干预后，显著抑制磷酸化ERK1/2的激活，相对的，总的ERK1/2蛋白水平在应用富氢介质干预后没有明显的变化。
　　 1.5、富氢介质对磷酸化Akt的影响
　　 研究显示P13k-Akt通路介导了由FBS诱导的血管平滑肌细胞的增殖和迁移，富氢介质对这个通路的影响在本实验中被调查，结果显示，FBS显著诱导Akt的激活，富氢介质显著地抑制由FBS所诱导的磷酸化的Akt的激活。
　　 1.6、富氢介质对PCNA表达的影响
　　 研究显示，FBS显著诱导了PCNA的表达，而应用了富氢介质后其表达明显受到抑制，说明富氢介质可以从核水平抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移。
　　 1.7、富氢介质对细胞内ROS水平的抑制效果
　　 细胞内ROS通过流式细胞分析用DCHF-DA测定，结果显示，FBS显著地诱导细胞内ROS的产生，平均MFI水平是483.0±15.1，富氢介质干预后，MFI水平是395.6±16.1，说明富氢介质显著抑制由FBS诱导的ROS的产生，P＜0.01。
　　 细胞内8-OHDG的水平由ELISA方法测定，结果显示，FBS显著地诱导细胞内8-OHDG的产生，其所测数值是1.6±0.1ng/ml，富氢介质干预后，所测数值是1.3±0.0ng/ml，说明富氢介质对FBS诱导的8-OHDG的产生有明显的抑制作用，P＜0.01。
　　 MDA是脂过氧化物的终末产物，结果显示，FBS显著地诱导细胞内MDA的产生，其所测数值是3.7±0.2ng/ml，富氢介质干预后，所测数值是2.9±0.1ng/ml，说明富氢介质对FBS诱导的MDA的产生有明显的抑制作用，P＜0.01。
　　 2、富氢盐水通过失活Ras-ERK1/2-MEK1/2通路及抑制ROS减轻大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜的增殖效果
　　 本部分实验在大体上，制作大鼠颈动脉球囊损伤的模型来模拟PTCA的过程，观察富氢盐水对新生内膜增殖的影响并探讨可能的机制。实验结果如下:
　　 2.1、富氢盐水对大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜增殖的影响
　　 和对照组相比，球囊损伤后内膜明显地增生。不同剂量的富氢盐水显示了以剂量依赖的形式抑制新生内膜的形成，和球囊损伤对照组相比，内膜与中膜的比值(I/M)减少了36.9％(2.5ml/kg组)，52.2％(5ml/kg组)and71.8％(10ml/kg组),P＜0.01。
　　 2.2、免疫组化分析富氢盐水对新生内膜中PCNA表达的影响
　　 PCNA阳性的细胞在球囊损伤组是丰富的，但应用了富氢盐水的动物标本中经免疫染色显示PCNA阳性的细胞明显减少，Sham组IOD值是15.11±1.42;球囊损伤对照组是53.42±2.30;在2.5ml/kg富氢盐水干预组其IOD值是45.25±1.62;5ml/kg组IOD是22.55±0.88;10ml/kg组IOD值是19.61±0.79。说明富氢盐水以剂量依赖的形式抑制了新生内膜中的PCNA的表达。
　　 2.3、富氢盐水通过抑制Ras-ERK1/2-MEK1/2通路抑制球囊损伤后新生内膜的增生
　　 结果显示，球囊损伤后新生内膜明显增生，相对应的Ras、磷酸化ERK1/2、磷酸化MEK1/2激活，应用富氢盐水后，以剂量依赖的形式抑制这些蛋白的表达，说明富氢盐水通过抑制Ras-ERK1/2-MEK1/2通路抑制球囊损伤后新生内膜的增生。
　　 2.4、富氢盐水对组织内ROS的抑制效果
　　 结果显示，球囊损伤后，颈动脉内膜组织内的8-OHDG明显增加，应用富氢盐水后，以剂量依赖的形式明显降低了8-OHDG的水平;球囊损伤后，颈动脉内膜组织内的MDA明显增加，应用富氢盐水后，以剂量依赖的形式明显降低了MDA的水平。说明富氢盐水通过抑制氧化应激而起到抑制球囊损伤后新生内膜的增殖。
　　 3、富氢介质通过促进细胞凋亡减轻血管平滑肌的增殖
　　 3.1、富氢介质对细胞凋亡的影响
　　 我们进一步用流式细胞术证实富氢介质诱导血管平滑肌细胞的凋亡。结果显示，对于早期凋亡，从1.36％(只用FBS处理)增加到2.1％(用FBS和富氢介质共同处理)，P＜0.05;对于晚期凋亡，从6.96％(只用FBS处理)增加到13.47％(用FBS和富氢介质共同处理)，P＜0.01;这些结果显示富氢介质诱导了血管平滑肌细胞的凋亡。
　　 3.2、富氢介质对Bax/Bcl2比值的影响
　　 为了进一步证实富氢介质对细胞凋亡的影响，用RT-PCR的方法测定了促进细胞凋亡和抑制细胞凋亡的蛋白并计算二者的比值，结果显示，用富氢介质处理后，Bax/Bcl2比值显著地增加(P＜0.01)，预示着富氢介质能够促进细胞凋亡。
　　 3.3、细胞内8-OHDG的水平由ELISA方法测定，结果显示，FBS显著地诱导细胞内8-OHDG的产生，其所测数值是1.6±0.1ng/ml，富氢介质干预后，所测数值是1.3±0.0ng/ml，说明富氢介质对FBS诱导的8-OHDG的产生有明显的抑制作用，P＜0.01。
　　 3.4、MDA是脂过氧化物的终末产物，如结果显示，FBS显著地诱导细胞内MDA的产生，其所测数值是3.7±0.2ng/ml，富氢介质干预后，所测数值是2.9±0.1ng/ml，说明富氢介质对FBS诱导的MDA的产生有明显的抑制作用，P＜0.01。
　　 结论：
　　 1、富氢介质可以有效抑制VSMCs的增殖和迁移，其可能的机制包括
　　 1.1、阻止细胞周期从G0/G1期向S期进展，此作用可能通过多种途径实现，其中在核水平抑制PCNA的表达是其重要机制之一。
　　 1.2、富氢介质通过抑制Ras-ERK1/2-MEK1/2通路抑制VSMCs的增和迁移
　　 1.3、富氢介质显著地抑制由FBS所诱导的磷酸化的Akt的激活。说明其通过P13k/Akt通路影响着VSMCs的增殖和迁移
　　 1.4、通过抑制PCNA的表达，从核水平抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移。
　　 1.5、富氢介质可以显著抑制细胞内ROS的产生，通过抑制氧化应激而发挥作用。
　　 2、富氢盐水可以有效抑制大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜的增殖，其可能的机制包括
　　 2.1、富氢盐水显著抑制组织内的ROS产生通过抑制氧化应激而发挥作用。
　　 2.2、通过抑制PCNA的表达，在核水平抑制VSMCs的增殖和迁移
　　 2.3、富氢介质通过抑制Ras-ERK1/2-MEK1/2通路来抑制新生内膜的增殖
　　 3、富氢介质通过促进细胞凋亡减轻血管平滑肌细胞的增殖和迁移
　　 3.1、富氢介质干预后无论早期凋亡还是晚期凋亡都明显的增加。
　　 3.2、促凋亡的蛋白和抑制凋亡的蛋白比值Bax/Bcl2增加预示着富氢介质通过这一机制减轻血管平滑肌细胞的增殖和迁移。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 富氢盐水通过失活Ras-ERK1／2-MEK1／2和Akt通路及抑制ROS减轻血管平滑肌细胞的的增殖

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分 富氧盐水通过失活Ras-ERK1／2-MEK1／2-通路及抑制ROS减轻大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜的增生

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分 富氢盐水通过促进细胞凋亡减轻血管平滑肌细胞的增殖

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述一 血管损伤及支架植入术后再狭窄机制的研究进展和相应对策

综述二 以组织学观点评估慢性闭塞性冠脉病变的基础导丝技术和标准的介入策略

致谢

个人简历