预防性应用曲克芦丁对STZ糖尿病大鼠认知功能障碍及海马Nrf2表达的影响

摘要

目的:随着人们生活方式的改变和人口老龄化，糖尿病的发病率正在急剧上升。糖尿病可以合并多种并发症，对糖尿病合并认知功能障碍的研究也越来越受到重视。氧化应激是糖尿病认知功能障碍发生、发展的重要机制。核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid-2-related factor2，Nrf2)是抗氧化应激的核心转录因子。早期预防治疗糖尿病认知功能障碍，可以延缓和减少痴呆的发生，提高糖尿病患者的生活质量。故本文通过对Nrf2与糖尿病大鼠认知功能障碍关系的分析，探讨曲克芦丁早期干预对预防糖尿病认知功能障碍的依据。
　　方法:
　　1.制备STZ糖尿病大鼠模型及分组:
　　健康雄性(Sprague-Dawley, SD)大鼠40只(鼠龄6-8w)，随机分为正常对照组(NC组，n=10只)，糖尿病组（n=30只），糖尿病组大鼠空腹过夜后一次性腹腔注射链脲佐菌素60mg/kg，72h后于尾静脉测随机血糖，血糖≥16.7mmol/L视为造模成功。成模后将糖尿病组大鼠随机分为糖尿病对照组（DC组，n=15），糖尿病曲克芦丁干预组（DT组，n=15）。
　　2.干预:
　　动物成模后，给予DT组腹腔注射曲克芦丁（60mg/kg）、DC组和NC组腹腔注射等量生理盐水每日注射1次，历时12周。
　　3.一般情况观察:
　　观察并记录大鼠精神状态及进食、饮食、尿量等一般情况，检测并记录血糖、体重变化。
　　4.行为学检测:
　　各组大鼠于成模12周后分别进行Morris水迷宫实验，包括前5天的定位航行实验以记录逃避潜伏期及第6天的空间探索实验以记录60s内穿越平台次数。
　　5.制备标本及观察指标:
　　水迷宫实验结束的第二天，将大鼠处死，断头、取海马组织以测定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活力、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量，用基因实时荧光定量-聚合酶链反应(R-T PCR)法检测Nrf2的mRNA水平以，用蛋白免疫印迹(Western-blot)法检测细胞Nrf2蛋白的表达，包括细胞内总蛋白和核内蛋白，用免疫组化法测定海马组织中Nrf2的表达水平。
　　6.统计学分析:
　　通过SPSS19.0统计软件处理实验数据，采用完全随机设计的单因素方差分析，重复测量方差分析（逃避潜伏期数据）统计，使用重复测量数据多重比较配对的t检验法(Bonferroni法)，可进行每个分组每个时间点上作用的两两比较，使用多元方差分析的方法，可进行每个时间点上每个分组之间作用的两两比较。因数据符合正态分布（P＞0.1），故应用均数±标准差表示结果，应用P＜0.05表示差异有统计学意义。
　　结果:
　　1.一般情况观察NC组大鼠血糖正常、体重稳定增长、皮毛光亮、反应灵敏等。DC组大鼠血糖明显升高(＞20.0mmol/L)，具备糖尿病的典型症状如多尿、多饮、多食等，逐渐出现皮毛枯黄、生长缓慢、消瘦、反应迟钝等现象。干预过程中，DT组大鼠血糖升高(＞20.0mmol/L)，消瘦情况与DC组相比差别无统计学意义，反应较DC组灵敏。
　　2.Morris水迷宫结果
　　2.1 基础游泳速度:各组大鼠游泳速度无统计学意义(P＞0.05)。
　　2.2 定位航行实验:
　　各组间的区别:与NC组相比，DC组逃避潜伏期延长(P＜0.01)，提示成模后12周，糖尿病大鼠出现认知功能障碍;与DC组相比，DT组逃避潜伏期缩短(P＜0.01)，提示曲克芦丁干预12周后，可减轻认知功能障碍。
　　第1天中NC组、DC组、DT组逃避潜伏期没有明显区别(P＞0.05);第2到5天，与NC组相比，DC组大鼠逃避潜伏期均延长(P均＜0.01);第2天，DC组与DT组逃避潜伏期没有明显区别(P＞0.05);第3到5天，DT组逃避潜伏期较DC组大鼠逃避潜伏期明显缩短（P均＜0.01）。
　　第5天与第1天逃避潜伏期的变化:NC组逃避潜伏期明显缩短（P＜0.01);DC组逃避潜伏期无明显变化（P＞0.05）;DT组，逃避潜伏期缩短(P＜0.05)，提示曲克芦丁干预12周后，可减轻认知功能障碍。
　　2.3 空间探索实验:
　　与NC组相比，DC组、DT组大鼠穿越平台次数减少(P＜0.01);与DC组相比，DT组大鼠穿越平台的次数增加(P＜0.01)。
　　3.海马组织HE染色结果NC组海马CA1区神经细胞形态正常，结构完整，排列整齐;DC组细胞排列紊乱，胞体缩小，胞质红色，正常形态神经细胞数量明显减少。DT组细胞形态正常，排列较整齐，结构较为完整。
　　4.免疫组化结果与NC组相比，DC组、DT组海马Nrf2阳性细胞的OD值均降低(P＜0.01);DT组的Nrf2阳性细胞的OD值与DC组相比增高(P＜0.01)。
　　5.Rt-PCR结果与NC组相比，DC组、DT组海马Nrf2mRNA表达量均降低(P＜0.01);DT组的Nrf2mRNA表达量均比DC组增高(P＜0.01)。
　　6.Western blot结果
　　6.1 细胞Nrf2总蛋白的表达:
　　与NC组相比，DC组、DT组的Nrf2总蛋白表达量均降低(P＜0.01);DT组的Nrf2总蛋白表达量与DC组相比增高(P＜0.01)。
　　6.2 细胞Nrf2核蛋白的表达:
　　相对于NC组，DC组、DT组的Nrf2核蛋白表达量均降低(P＜0.01);DT组的Nrf2核蛋白表达量与DC组相比增高(P＜0.01)。
　　7.SOD和MDA结果:
　　SOD活力:DC组SOD活力弱于NC组(P＜0.05);DT组与NC组无统计学差异(P＞0.05); DT组与DC组相比增强(P＜0.05)。
　　MDA含量:DC组的MDA含量高于NC组（P＜0.01）;DT组与NC组无统计学差异(P＞0.05);DT组的MDA含量与DC组相比降低(P＜0.01)。
　　结论:
　　1.认知功能障碍的STZ糖尿病大鼠其SOD活力减弱，MDA含量增加，且大鼠海马Nrf2表达下调。
　　2.预防性应用曲克芦丁可能通过上调STZ糖尿病大鼠海马Nrf2表达，提高其学习记忆能力，延缓糖尿病大鼠认知障碍的发生。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 实验方法

3 统计学方法

结果

1 一般情况观察

2 Morris水迷宫结果

3 海马组织HE染色结果

4 免疫组化结果

5 Rt-PCR结果

6 Western blot结果

7 SOD和MDA结果

附图

附表

讨论

1 STZ糖尿病大鼠认知功能障碍模型

2 水迷宫

3 海马组织与认知功能障碍

4 SOD活性与MDA含量

5 Nrf2

6 曲克芦丁

结论

参考文献

综述 氧化应激与糖尿病认知功能障碍的预防

致谢

个人简历