舒洛地特对膜性肾病大鼠HSPG、Heparanase表达的影响

摘要

目的:膜性肾病是成人原发性肾病综合征的常见病因，病理主要表现为肾小球脏层上皮细胞下免疫复合物弥漫性沉积、肾小球基底膜增厚伴“钉突”形成，临床主要表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症。大量蛋白尿已成为肾脏病进展的独立危险因素，有效控制蛋白尿可以延缓肾脏病进展。近年国外研究发现硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(Heparan sulfateproteoglycans，HSPG)在肾脏过滤装置中大量表达，尤其是肾小球基底膜，生化学研究显示，HSPG是GBM上不可或缺的有机组成成分。在很多肾病中，包括糖尿病肾病、微小病变和膜性肾病，HSPG表达下降，一般HSPG表达下降与尿蛋白水平升高有关。且研究发现在被动性Heyemann肾炎（给大鼠直接注射抗刷状缘抗体造成类似于人类膜性肾病的肾炎表现）中类肝素酶(Heparanase HPA)在内皮和肾脏上皮细胞表达增加对尿蛋白形成是有作用的。HPA可以有选择性的作用于基底膜上HSPG带有负电荷的侧链，带负电荷的HSPG的缺失可改变肾小球基底膜的通透性，导致蛋白漏出。舒洛地特可以抑制类肝素酶，修复内皮细胞负电荷，减少带负电荷蛋白的漏出。应用舒洛地特是否可以通过降低膜性肾病肾脏内皮及上皮细胞类肝素酶的表达，进而使HSPG的表达上调而发挥降低尿蛋白作用？目前国内外尚缺乏该方面的研究。本实验通过检测HSPG、HPA在膜性肾病大鼠肾脏中的表达，并应用舒洛地特给予干预，研究HSPG与HPA之间的关系，探讨舒洛地特降低膜性肾病蛋白尿的相关机制，从而为延缓膜性肾病的肾脏病变进展提供新的思路。
　　方法:选择清洁级健康雄性SD大鼠40只，体重160±20g，适应性饲养1周后，检测尿蛋白均为阴性，随机将其分为4组，正常对照组、模型组、高剂量舒洛地特组、低剂量舒洛地特组，每组10只。模型组、高剂量舒洛地特组、低剂量舒洛地特组应用自备阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)预免疫1周后，隔日尾静脉注射C-BSA，正常对照组尾静脉注射等体积生理盐水，连续4周后代谢笼中留取各组大鼠24小时尿液，检测24小时尿蛋白定量。造模成功后高剂量舒洛地特组给予舒洛地特20mg/kg灌胃，低剂量舒洛地特组给予舒洛地特10mg/kg灌胃。模型组和正常对照组灌服等体积生理盐水，各组大鼠自由进食、饮水。连续4周后再次代谢笼中留取各组大鼠24小时尿液，检测24小时尿蛋白定量，之后处死大鼠，留取肾组织，分别应用HE、Masson和PAS染色在光镜下观察肾小球基底膜病变情况，并通过电镜观察肾小球基底膜及足突病理变化，应用免疫组织化学方法检测HSPG、HPA的表达情况，结果应用图像分析系统IPP(Image-Pro Plus)进行半定量分析。实验数据用均数±标准差((x)±S)表示，各组间比较采用单因素方差分析（满足正态性和方差齐性），两组间比较采用两独立样本t检验，不满足正态性和方差齐性的数据资料采用非参数检验，应用SPSS13.0统计分析软件处理实验数据，以P＜0.05为具有统计学意义。
　　结果:
　　1.24小时尿蛋白定量
　　隔日尾静脉注射C-BSA，连续4周后，模型组、高剂量舒洛地特组、低剂量舒洛地特组均出现大量蛋白尿，与正常对照组比较有显著性差异（P均＜0.05），连续舒洛地特灌胃4周后，高剂量舒洛地特组与低剂量舒洛地特组24小时尿蛋白较前均降低，与模型组相比有显著性差异（P均＜0.05），与低剂量舒洛地特组相比，高剂量舒洛地特组24小时尿蛋白降低更明显（P＜0.05）。
　　2.肾组织病理形态学观察
　　光镜及电镜下正常对照组肾小球结构无明显异常。模型组光镜下肾小球基底膜明显增厚，电镜下肾小球基底膜内大量电子致密物沉积，足细胞足突弥漫融合。与模型组相比，低剂量舒洛地特组与高剂量舒洛地特组光镜下肾小球基底膜轻度增厚，电镜下肾小球基底膜电子致密物沉积减少，足细胞足突融合减轻。
　　3.肾组织中HSPG、HPA免疫组化结果
　　HSPG在正常对照组肾小球基底膜上大量表达，模型组、低剂量舒洛地特组及高剂量舒洛地特组肾小球基底膜上有表达，较正常对照组表达降低，有统计学差异（P均＜0.05），模型组较低剂量舒洛地特组及高剂量舒洛地特组表达均降低，有统计学差异（P均＜0.05），低剂量舒洛地特组较高剂量舒洛地特组表达降低，有统计学差异（P＜0.05)。
　　HPA在模型组肾小球内皮及上皮细胞大量表达，正常对照组微量表达，低剂量舒洛地特及高剂量舒洛地特组有表达，较模型组表达均降低，有统计学差异（P均＜0.05），较正常对照组表达增加，有统计学差异（P均＜0.05），模型组与正常对照组相比表达明显增强，有显著性差异（P＜0.05）。
　　4.相关性分析
　　对HSPG的表达水平与HPA的表达情况进行了Pearson相关分析，结果表明:HSPG与HPA的表达水平呈负相关（r=-0.932，P＜0.05）。
　　结论:
　　1.舒洛地特可以降低膜性肾病大鼠尿蛋白程度。
　　2.舒洛地特可能通过抑制HPA在肾组织的表达，上调肾小球基底膜上的HSPG表达，从而具有改善肾小球基底膜的通透性，减轻肾脏损伤，降低蛋白尿的作用。
　　3.高剂量舒洛地特较低剂量舒洛地特治疗效果明显。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 实验方法

结果

1 实验动物的一般情况观察

2 各组大鼠24小时尿蛋白定量比较

3 各组大鼠肾组织病理形态学观察

4 免疫组化观察肾组织中HSPG、HPA的表达情况

5 相关性分析

附图

附表

讨论

1．膜性肾病模型的建立

2．类肝素酶的结构以及对大鼠膜性肾病模型蛋白尿的影响

3．膜性肾病的治疗

4．舒洛地特对膜性肾病蛋白尿的影响

结论

参考文献

综述 类肝素酶与蛋白尿研究进展

致谢

个人简历