血浆中游离药物分析方法的理论研究与临床应用

摘要

药物在血浆中以不同的程度与血浆蛋白结合，只有未与血浆蛋白结合的游离药物(FD)才能在作用部位产生疗效，这是临床药理学的基本共识。然而在临床实践中FD评价并没有在临床得到广泛应用，用血浆中总药物(TD)浓度去评价药效学、指导用药仍然是目前常用的手段，因而，毒副反应和治疗失败的现象时有发生。其原因除了FD与临床病理生理的关系目前并不十分清晰外，FD的表征方法的不完善是另一重要原因。因此，研究开发准确、适宜临床的FD分析方法是临床药学工作者面临的重要课题，也是解决FD评价在临床实际应用的一个关键问题。
　　离心超滤(CF-UF)法是目前FD分析表征的主要方法，但是其所得超滤液的体积(Vu)一般较大，且无法准确控制，容易破坏药物蛋白结合平衡，导致FD分析的准确度和精密度受到影响，目前有关CF-UF准确度与Vu关系的理论研究还未见报道，也未见准确控制Vu的方法和技术的报道。
　　课题以抗癫痫药-卡马西平(CBZ)为模型药物，研究了CF-UF表征FD浓度时不同的Vu对FD分析准确度的影响及规律，完善了CF-UF表征FD的理论。方法采用高、低两个浓度的质控血浆样本，在相同的离心力8.0×103 g下，通过改变离心时间(0.5、2、5、10、15和20 min)而得到不同的超滤液与样本溶液体积比（Vu/Vs），并分别进行HPLC分析，结果显示Vu/Vs从0.08增大到0.8，游离的CBZ的浓度逐渐增大，而蛋白结合率(PB)从70％变到40％，表明随着Vu/Vs的增加，游离药物随超滤液滤出，样品溶液中结合药物的浓度逐步增加，由于药物与蛋白结合平衡的存在，与蛋白结合的药物会逐步释放药物以满足平衡的需要。可见Vu/Vs对FD表征准确度的影响是不容忽视的。结果表明，对于CBZ，当Vu/Vs＜0.2时，FD的表征结果才容易被接受。
　　为了准确控制Vu/Vs，本文提出了中空纤维离心超滤(HFCF-UF)技术，其Vu/Vs较小且恒定为0.08，CBZ的PB在72％左右，并且在理论上提出了Vu/Vs可以通过超滤玻璃管和中空纤维（HF）的内径准确控制，所得结果更加准确，为FD分析提供了一个可靠的技术手段。
　　蛋白结合型药物会受到Vu/Vs的影响，而对于非蛋白结合型(NPB)药物，采用CF-UF法得到的FD浓度就可以等同于TD浓度，用于临床药代动力学等研究。CF-UF法与传统的TD浓度表征方法相比，操作简便，方法学分析结果理论上应该优于其它方法，但是其在实际应用中，并非如此简单，较大的和无法准确控制的Vu/VS是否也会影响血浆中NPB药物浓度的分析还未见报道，而这些都是准确评价药物浓度的关键问题。
　　本课题以PB很小的抗生素-比阿培南(BAN)为代表，研究了在采用CF-UF法分析BAN药物浓度时，不同Vu/Vs对药物浓度的准确度影响的理论，两个不同浓度的BAN质控血浆样本置于CF-UF装置中，在1.0×104g离心力下，通过不同的离心时间(0.2、1、5、10、20、40和60 min)，得到不同的Vu/Vs，并分别分析其药物浓度。结果显示，随着Vu/Vs的增加，在Vu/Vs不超过0.4时，药物浓度基本不变，但是当Vu/Vs大于0.4时，药物浓度会随着Vu/Vs的增大而增大。因此，在CF-UF法表征NPB药物浓度时，将Vu/Vs控制在0.4以下是准确分析的一个关键。但是由于CF-UF方法还无法准确控制Vu/Vs，而本课题提出的HFCF-UF装置，其可以准确的将Vu/Vs控制在0.08，得到的方法学结果更加准确和精密，成为血浆中NPB药物浓度分析的一个适宜平台。
　　对于PB较高的药物而言，由于其FD浓度比较低，Vu/Vs对准确度的影响更加明显，这就需要一个更加准确的FD浓度分析方法。抗癫痫药-丙戊酸钠(VPA)，其PB为95％，在临床应用中会出现个体差异大，毒副反应多见的现象。已有研究指出了VPA很有必要以FD浓度进行TDM，但是目前在临床实践中仍然以TD作为临床评价指标，这是由于VPA的FD浓度比较低，且需要一个准确简便的、不破坏药物蛋白结合平衡的FD分离技术，但是当前的分析方法还不能实现，这就限制了游离的VPA在TDM中的应用。本文采用HFCF-UF装置，建立了游离VPA的分析方法。取0.5mL血浆样本置于HFCF-UF中，在1.25×103g的离心力下，离心15min，得到滤液40μL，并采用2-溴甲基-2-萘乙酮衍生，进行HPLC分析。由于Vu/Vs较小，且可以准确控制，几乎不破坏药物蛋白结合平衡，分析结果更加准确，衍生技术又明显提高了检测灵敏度，所建方法成功应用于VPA的临床TDM。
　　血浆中水溶性药物含量分析的样品前处理技术常采用萃取法或蛋白沉淀(PPT)法，但是这些方法具有操作步骤多，稀释样品等特点，导致方法的灵敏度较低，且回收率通常仅为60％左右，甚至更低。因此，寻求一种无样品前处理的直接进样技术，避免繁琐的操作，提高方法回收率，是分析工作者研究的一个热点。而这些水溶性药物多是PB较低的药物，因此可以直接采用HFCF-UF法分析血浆中药物浓度，达到样品零处理的目的。阿莫西林（AMO）是一种半合成β-内酰胺类抗生素，其药代动力学研究常常以PPT法分析TD浓度，但PPT法需要加入大量沉淀试剂，稀释血浆样品而降低检测灵敏度，且未沉淀完全的蛋白会影响测定结果的准确性。由于AMO的PB较低（15％左右），故本课题以AMO为代表，建立了HFCF-UF方法分析血浆中水溶性药物浓度的直接进样方法。取0.5mL样本置于HFCF-UF中，在1.25×103 g的离心力下，离心15 min，取超滤液20μL直接进行HPLC分析，并与PPT法进行对比分析，结果显示，两种方法所得结果无统计学差异。HFCF-UF方法操作简便、方法学准确精密，成功用于AMO的临床药代动力学研究，为血浆中水溶性药物的含量分析提供了一种简便准确、零样品前处理的技术手段。

目录

声明

摘要

英文缩写表

引言

第一部分 血浆中游离药物分析方法的理论研究

一、超滤液与样本溶液的体积比对血浆中蛋白结合型药物的游离浓度分析影响的理论研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

二、超滤液与样本溶液的体积比对血浆中非蛋白结合型药物浓度分析影响的理论研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 游离药物分析方法-中空纤维离心超滤在丙戊酸钠的临床治疗药物监测中的应用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 游离药物分析方法-中空纤维离心超滤在阿莫西林的临床药代动力学研究中的应用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 血浆中游离药物分析方法的研究与应用进展

致谢

个人简历