一个局灶节段性肾小球硬化家系全基因组测序分析

摘要

目的:局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，FSGS)是成人及儿童原发性肾小球疾病的常见病理类型，临床表现为不同程度蛋白尿、进行性肾功能不全，可伴镜下血尿、血压升高等，部分对激素及免疫抑制剂治疗不敏感，较快进展至肾衰竭，预后较差。在西方国家，原发性肾小球疾病是导致终末期肾脏疾病(end-stage renal disease，ESRD)的第三大病因，其中FSGS占据重要比例，约占成人原发性肾病综合征(nephrotic syndrome，NS)的12％-35％，并呈逐年上升趋势。国内导致ESRD的首要原因仍是原发性肾小球疾病，其中FSGS占3.2-5.8％。FSGS的发病机制不清，分为原发性、继发性及家族性三种类型。家族性局灶节段性肾小球硬化(familial focal segmental glomerulosclerosis，FFSGS)是一种常染色体遗传性疾病，分为常染色体显性(AutosomalDominant，AD)及常染色体隐性(Autosomal Recessive，AR)。有学者报道，约超过18％的FSGS有家族聚集现象。近年来，国内外通过基因连锁分析、定位克隆以及新一代测序的方法，发现并证实多个FFSGS致病基因如NPHS2、ACTN4、TRPC6、CD2AP、PLCE1、LMX1B、LAMβ2、INF2、MYO1E等，其编码蛋白均位于足细胞及其裂孔隔膜上，基因突变后导致编码的蛋白功能或结构发生改变，通过影响细胞骨架结构、信号转导、细胞稳态等多方面导致足细胞损伤破坏肾小球滤过屏障从而引起蛋白尿，这也提示足细胞在FFSGS发生发展中起关键作用，因此对FFSGS致病基因筛查及功能研究，有助于更好的认识足细胞致病的机理以及为早期诊断和有效治疗提供重要的指导意义。
　　随着人类基因组计划(Human Genome Project，HGP)及国际人类基因组单体型图计划（The international HapMap project）的完成，新一代测序技术得以迅猛发展，近些年通过全基因组测序(Whole GenomeSequencing，WGS)技术在孟德尔遗传性疾病、复杂疾病、罕见病以及癌症等疾病研究中，发现了一系列致病基因，已经成为寻找致病基因、探究疾病发生发展机制的重要工具。全基因组测序是对基因组序列一致的个体进行基因组测序，然后与已知序列比对，在个体或群体水平上进行差异性分析，较全外显子测序(whole-exome sequencing，WES)更能从单核苷酸变异(Single Nucleotide Variations，SNVs)、插入/缺失(Insertions&Deletions，InDels)、染色体结构变异（Structure Variations，SVs）及拷贝数变异(Copy Number Variations，CNVs)等多方面发现疾病的遗传特征或突变位点，但价格昂贵一直阻碍了全基因组测序技术的普及。2014年，HiseqX Ten测序仪的问世，大大降低了测序成本，推动了全基因组测序技术在遗传疾病的筛查、个体化靶向用药指导、患癌风险评估等领域的广泛应用，为实现疾病的早期发现、早期诊断、早期干预及精准治疗创造了条件。
　　本课题采用Hiseq XTen测序仪对一个经临床、实验室及病理检查明确为FFSGS家系中的2名患者及其母亲进行全基因组测序，对结果进行多步骤筛选分析，初步筛选出该家系的候选基因，为进一步确定FFSGS致病基因提供依据。
　　方法:收集一个局灶节段性肾小球硬化家系中2名患者及其母亲外周静脉血，应用QIAGEN基因组DNA试剂盒提取DNA，采用Hiseq XTen测序仪对三人进行全基因组测序，测序结果与人类基因组单体型图(HAPMAP)数据库、多核苷酸多态性数据库(Single NucleotidePolymorphism basedata，dbSNP138)、千人基因组计划(1000 GenomeProject)数据库注释信息进行比对，过滤掉已报道的常见变异，筛选外显子区和剪接区变异，然后去除其中的同义突变，再利用SIFT(SortingIntolerant From Tolerant)、Polyphen-2(PolymorphismPhenotyping2)软件筛选出能导致编码蛋白功能异常的候选基因，最后利用在线人类孟德尔遗传(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)数据库、基因本体(GeneOntology, GO)数据库和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes，KEGG)数据库分析其生物学特征及编码蛋白可能的作用机制。
　　结果:通过对测序结果初步筛选共获得两个患者及其母亲SNVs位点数目分别为:3038061、3132594和3037609个;InDels位点数目分别为:401259、432406、398040个;SVs位点数目分别为:2917、2211和3088个;CNVs位点数目分别为:135、211和91个。再通过多重过滤筛选得到SNVs位点数目分别为:106、94和104个，两名患者共有的位点数目为54个; InDels位点数目分别为604、590和628个，两名患者共有的位点数目为455个。最后整合三人共有的非同义突变，筛选出19个候选基因。
　　结论:KDM4A, TCF7L1, ADRA2B, KIF1A, TOP2B, GPR115, AK9,KCNT1, WDR96, ZNF384, KRT3, DDX55, ADCK1, TIPIN, JMJD8, STUB1,FAM83G, SLC5A10，SH3BGR19个基因是家族性局灶节段性肾小球硬化的候选基因，是否为该家系的致病基因，后续需行Sanger测序及进一步进行相关功能学验证。

目录

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摘要

英文缩写

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 家族性局灶节段性肾小球硬化致病基因的研究进展

致谢

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