糖尿病大鼠肾组织NF-κB、TGF-β的表达及瑞格列奈对其干预作用的研究

摘要

目的:糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病(DiabetesMellituse，DM)最常见的严重微血管并发症之一。近年来研究发现，氧化应激、炎症反应和纤维化在糖尿病肾病发生发展过程中发挥了重要作用。糖尿病时机体处于氧化应激状态，通过产生过多的活性氧簇(ReactiveOxygen Species，ROS)直接损伤机体蛋白质和核酸等生物大分子，还可通过激活多功能转录调节因子NF-κB（Nuclear Transcription FactorκB)，促进多种炎症因子、巨噬细胞及促肾脏纤维化关键因子TGF-β等的过度表达，共同导致肾脏病变。如何阻断或抑制氧化应激及炎症反应，减缓肾脏纤维化成为预防和治疗DN的关键。瑞格列奈(Repaglinide，RE)是一种非磺酰脲类促胰岛素分泌剂，是Ⅱ型糖尿病患者临床一线口服降糖药物，可有效控制餐后血糖。有研究报道，RE还可减缓DN进展，但确切机制尚不明了。
　　本课题拟通过建立链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)诱导的DM大鼠模型，测定大鼠肾脏组织中氧化应激指标丙二醛(MDA)含量及总抗氧化能力(T-AOC)活性，应用免疫组织化学、实时定量荧光PCR(real-timeFQ-PCR)等方法检测肾组织中NF-κB、TGF-β表达情况，并予瑞格列奈(Repaglinide，RE)2mg/Kg进行干预，观察DM大鼠肾脏组织内氧化应激、炎症反应及纤维化状况，并探讨瑞格列奈对其存在的干预作用及机制，为人类糖DN的防治提供理论依据。
　　方法:选择健康雄性清洁级SD大鼠36只，体重约200±20g，（购自河北医科大学动物中心），随机分为正常对照(NC组，n=12)、糖尿病模型组（DM组，n=12）、糖尿病瑞格列奈干预组（RT组，n=12）。适应性喂养1周后，空腹12小时，糖尿病模型组大鼠一次性腹腔注射STZ(65 mg/kg)，72h后尾静脉取血检测血糖≥16.7mmol/L，尿糖+++～++++，视为造模成功。NC组一次性腹腔注射等剂量柠檬酸缓冲液。试验期间所有大鼠均自由进食水，动物房温度(20℃～26℃)、湿度(40％～70％)相对恒定。RT组大鼠给予瑞格列奈（RE）2mg/kg，1/日，植物油溶剂灌胃，NC组、DM组每天予等量植物油灌胃。分别于造模成功后8周、12周末，每组任取6只大鼠，测定24h尿蛋白(24 hUP)、血糖、尿素氮、血肌酐。并收集大鼠肾组织标本，制备组织切片，行苏木素-伊红染色(HE染色)及糖原染色(PAS)，光学显微镜下观察大鼠肾脏病理变化;检测肾组织MDA含量、T-AOC活性，免疫组织化学及real-time PCR方法检测TGF-β、NF-κB的表达。实验所得数据用均数±标准差（(x)±S）表示，应用SPSS16.0统计分析软件对数据进行单因素方差分析，不满足正态性和方差齐性的数据资料采用非参数检验，P＜0.05有统计学意义。
　　结果:
　　1、一般情况
　　DM组、RT组大鼠腹腔注射STZ后逐渐出现多饮、多食、多尿，反应迟缓，毛发失去光泽，体重逐渐下降，其中DM组症状较RT组明显加重，而NC组大鼠饮食正常，反应灵敏，生长发育良好，体重明显增长。
　　2、生化指标
　　2.124小时尿蛋白定量
　　与同期NC组相比，8周末、12周末，DM组、RT组大鼠24小时尿蛋白水平均升高(P＜0.05);与同期DM组相比，RT组大鼠24小时尿蛋白水平降低(P＜0.05)。
　　2.2血糖
　　与同期NC组相比，8周末、12周末，DM组、RT组大鼠血糖水平均明显升高（P＜0.05）;与同期DM组相比，RT组血糖变化不明显(P＞0.05)。
　　2.3血肌酐、尿素氮
　　与同期NC组相比，8周末、12周末，DM组、RT组大鼠血肌酐、尿素水平升高（P＜0.01）;与同期DM组相比，RT组血肌酐、尿素氮水平下降（P＜0.05）。
　　3、氧化应激指标
　　3.1 MDA测定
　　与同期NC组相比，8周末、12周末，DM组、RT组大鼠肾组织MDA水平显著升高（P＜0.05）;与同期DM组相比，RT组MDA水平均有不同程度的下降(P＜0.05)。
　　3.2 T-AOC测定
　　与同期NC组相比，8周末、12周末，DM组、RT组大鼠肾组织内的T-AOC活性显著降低(P＜0.05);与同期DM组相比，RT组T-AOC活性升高(P＜0.05)。
　　4、肾脏组织变化
　　光镜显示，NC组大鼠肾脏组织结构清晰，肾小管上皮细胞排列整齐，基底膜染色均匀一致，无系膜细胞及系膜基质增多等异常改变。与NC组相比，DM组肾小球体积增大，肾小球系膜基质弥漫增多，系膜细胞增多，基底膜增厚，12周末时病理改变更明显。RT组肾脏组织结构较DM组得到改善。
　　5、免疫组织化学检测
　　与同期NC组相比，8周末、12周末，DM组、RT组NF-κB、TGF-β表达均增多(P＜0.05);与同期DM组相比，RT组NF-κB、TGF-β表达水平不同程度下降(P＜0.05)。
　　6、Real-time FQ-PCR检测
　　与同期NC组相比，8周末、12周末时，DM组、RT组NF-κB mRNA、TGF-βmRNA表达均增多(P＜0.05);与同期DM组相比，RT组NF-κBmRNA、TGF-βmRNA表达水平不同程度下降(P＜0.05)。
　　结论:
　　1、 DM大鼠肾脏组织MDA表达增高，T-AOC活性降低，提示处于氧化应激状态，同时NF-κB、TGF-β表达升高，表明有炎症反应及纤维化机制参与。
　　2、瑞格列奈可减少DM大鼠蛋白尿的产生、改善肾脏功能;可降低肾脏组织MDA含量，提高T-AOC活性并减少NF-κB、TGF-β表达，从而减轻氧化应激、炎症反应，延缓肾脏纤维化，起到肾脏保护作用。

目录

声明

摘要

英文缩写

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历