CD44、CD24标记的宫颈癌细胞亚群特性及其辐射抵抗机制的研究

摘要

目的:宫颈癌是危害女性健康的最常见恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居妇科恶性肿瘤第2位。目前临床上主要通过手术、放疗、化疗等手段综合治疗。中晚期宫颈癌治疗效果差，主要是病灶转移和复发，5年内肿瘤复发率高并且复发后对于放疗、化疗具有很强的抵抗性。肿瘤干细胞(cancer stem cell CSC)领域取得的成就，为疾病的治疗和预后开辟一条崭新的道路。宫颈癌干细胞（cervical cancer stem cells CCSC）也成为妇科肿瘤专家们最为关心的问题，CSC理论有助于我们对宫颈癌传统治疗观念的转变，为治愈宫颈癌提供新的方法。
　　研究已证实宫颈癌组织及宫颈癌细胞系中存在具有CSC特性的细胞，但到目前为止尚未根据特异性肿瘤标志物从宫颈癌细胞系中分离、鉴定出CCSC。前期课题已证实经过2Gy反复辐射Siha细胞25次，流式细胞仪检测发现CD44+/CD24+Siha细胞亚群比例较辐射前明显升高，因此本研究拟通过流式细胞仪分选得到CD44+/CD24+Siha细胞，利用悬浮培养法、裸鼠成瘤实验、Transwell小室侵袭实验、电镜、克隆形成实验了解其是否具备干细胞特性。对于Siha细胞系中CD44+/CD24+能否被认为是宫颈癌的干细胞标志物提供一个理论支持。流式细胞仪检测辐射前后细胞周期变化，进一步探讨CD44+/CD24+Siha细胞放疗抵抗性与细胞周期之间的关系。
　　方法:
　　1细胞培养常规复苏冻存的Siha细胞，用含10％胎牛血清的1640培养基传代培养，置于5％C02、37℃的恒温培养箱中。
　　2流式细胞仪分选细胞将Siha细胞制成单细胞悬液，加入CD24-FITC、CD44-PE抗体后用流式细胞仪分选出CD44+/CD24+Siha细胞（传代培养或冻存）。
　　3悬浮培养检测成球能力将分选获取的CD44+/CD24+Siha细胞和亲代Siha细胞置于无血清条件下进行悬浮培养，观察其成球能力。
　　4裸鼠成瘤实验取CD44+/CD24+Siha细胞和亲代Siha细胞，适量培养基重悬细胞，抽取0.1ml细胞悬液皮下注射于4周龄雌性NOD/SCID小鼠的右前肢背侧，观察动物一般情况、瘤体生长情况并计算瘤体的体积。
　　5细胞照射采用Primus M电子直线加速器6MVX线为放射源，源皮距100 cm照射，剂量率300cGy/min。
　　6电镜透射电镜观察辐射前后两组细胞形态变化并照相。
　　7 Transwell侵袭实验测定两组细胞侵袭能力的变化
　　不同剂量照射CD44+/CD24+Siha、亲代Siha细胞后，将各组细胞逐滴加入Matrigel胶包被的Transwell小室，37℃、5％C02恒温培养箱中培养24h，4％多聚甲醛固定，吉姆萨液染色，计数各组细胞穿过Matrigel生物胶落人小孔的细胞数。
　　8克隆形成实验两组细胞经不同剂量照射后接种于六孔板中，六孔板底部出现肉眼可见的克隆时终止其培养，4％多聚甲醛固定，吉姆萨液染色，40倍显微镜下计数＞50个细胞的克隆数，计算细胞克隆形成率及两组细胞的存活分数。
　　9细胞周期检测两组细胞在接受4Gy放射处理后24小时，置于预冷的75％乙醇4℃固定过夜，PBS水化后离心倾去上清液，加入细胞周期检测剂，置暗处冰浴中染色30min，流式细胞仪检测放射前后细胞周期分布变化。
　　10统计学方法应用SPSS21.0统计软件进行数据处理，满足正态性计量资料采用均数±标准差描述其分布，用t检验或单因素方差分析比较各组差异;非正态性计量资料采用中位数±四分位数间距描述其分布，非正态性或方差不齐时用秩和检验比较各组差异，认为P＜0.05有统计学意义。
　　结果:
　　1 FCM检测不同组细胞中CD44+/CD24+细胞比例
　　亲代Siha细胞中CD44+/CD24+比例为1.12％;经2Gy反复辐射25次的Siha细胞被称为耐放疗细胞，其CD44+/CD24+Siha细胞亚群比例为4.68％。
　　2悬浮培养法检测两组细胞成球能力情况
　　CD44+/CD24+Siha细胞组可以形成致密且体积较大的细胞球，成球率为(36.0±4.52)％VS(6.1±2.85)％，P＜0.05，差异有统计学意义。
　　3裸鼠移植瘤的生长情况及移植瘤随时间体积的变化情况
　　3.1 CD44+/CD24+Siha细胞组接种(4.50±3.25)天NOD/SCID小鼠可触及米粒样结节形成;亲代Siha细胞组接种(12.88±2.69)天可触及米粒样结节形成。CD44+/CD24+Siha细胞组致瘤时间早，成瘤率高。
　　3.2两组移植瘤体积在各时间点比较均有明显差异(P＜0.05）。
　　4透射电镜观察辐射前后两组细胞内部结构变化
　　辐射后CD44+/CD24+Siha细胞组其细胞膜完整，核膜及核质较完整，细胞质内容物未见明显变化。而亲代Siha细胞组其细胞可见较多囊泡，核质聚集固缩，染色质边集及凋亡小体。
　　5克隆形成实验法检测两组细胞的放射敏感性
　　细胞存活曲线显示CD44+/CD24+Siha细胞组、亲代Siha细胞组均随着照射剂量的增加细胞存活分数不同程度下降，CD44+/CD24+Siha细胞组下降不明显。SF2Gy为日常照射剂量，SF2GyCD44+/CD24+细胞组=0.894±0.027，SF2Gy亲代Siha细胞组=0.745±0.056，两组比较有统计学差异(P＜0.05）。DoCD44+/CD24+细胞组=4.588±1.037与Do亲代Siha细胞组=3.195±0.519两组比较有统计学差异(P＜0.05）。DqCD44+/CD24+细胞组=4.114±0.854与Dq亲代Siha细胞组=2.154±0.337两组比较有统计学差异(P＜0.05)
　　6 Transwell实验法检测不同剂量照射后对两组细胞体外侵袭能力的影响
　　在0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy时CD44+/CD24+Siha细胞组与亲代Siha细胞组迁移细胞数差异均具有统计学意义(P＜0.05）。对于CD44+/CD24+Siha细胞组:2Gy、4Gy照射后迁移细胞数变化不具统计学意义(P＞0.05），6Gy、8Gy照射后迁移细胞数变化具有统计学意义(P＜0.05）;亲代Siha细胞组:2Gy照射后迁移细胞数变化不具统计学意义(P=0.05），4Gy、6Gy、8Gy照射后迁移细胞数变化具有统计学意义(P＜0.05）。
　　7流式细胞术检测辐射前后对两组细胞细胞周期分布的影响
　　CD44+/CD24+Siha细胞4Gy照射前后G2期细胞比例分别为32.38±12.50、46.82±6.75，差异有统计学意义(P＜0.05）;亲代Siha细胞4Gy照射前后G2期细胞比例分别为11.08±1.94、22.21±11.20，差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　结论:
　　1 CD44+/CD24+Siha细胞亚群成球能力强;致瘤时间早、致瘤率高、致瘤体积大;较强的侵袭和转移能力，其具备干细胞特性，CD44+/CD24+可能成为宫颈癌干细胞特异性表面标志物。
　　2 CD44+/CD24+Siha细胞亚群具有较强的放疗抵抗性。
　　3 CD44+/CD24+Siha细胞亚群较强的放疗抵抗性可能与G2周期阻滞有关。

目录

声明

摘要

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前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 宫颈癌干细胞的富集与分离方法及其指导临床的意义

致谢

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