银杏叶提取物对小鼠黑素瘤B16细胞的增殖和凋亡的影响

摘要

目的:近年来由于中药研究的不断发展，银杏受到多数研究学者的重视，并对其叶、花、果及外种皮等进行了不同程度的药理学研究，其对银杏叶提取物(ginkgobiloba extract，EGB)研究颇为深入。EGB是一种标准的银杏叶提取物，含24％的黄酮（主要是橡黄素、山萘酚和异鼠李素）和6％的内酯（含2.8％～3.4％银杏三内酯和2.6％～3.2％银杏新内酯），它们是EGB中最重要的活性物质，其他的组分还包括原花青素、葡萄糖、鼠李糖、有机酸、D-糖质酸和白果酸。目前，EGB制剂已作为一种治疗药物广泛应用于一些心血管和神经性功能障碍的疾病。近年来，很多研究证明EGB有一定的抗肿瘤作用，还有放射增敏效果，同时，并不增加正常组织的急性放射性损伤，但EGB抗黑色素瘤的研究鲜有报告，且作用机制尚不清楚。恶性黑素瘤(malignant melanoma，MM)是一种高度恶性的肿瘤，多发生于皮肤，国外统计占所有恶性肿瘤的1％～2％，在癌症死亡病例中，MM约占1％。且发病率有逐年上升的趋势。其转移早而广泛，而且对手术、放化疗效果欠佳，且副作用大，是一种临床治疗上颇为棘手的恶性肿瘤。有研究发现，EGB抑制肿瘤增殖及诱导凋亡，降低肿瘤细胞的表面标记物;能上调P53mRNA基因的表达、下调Bcl-2mRNA基因表达及提高Caspase-3的活性，阻滞肿瘤细胞进入分裂期，促进细胞凋亡。因此，EGB抗肿瘤的活性的机制便成为人们研究的热点之一，但EGB对恶性黑素瘤B16细胞的作用目前尚未见报道。
　　本实验通过EGB对小鼠黑素瘤B16细胞的增殖、凋亡及Caspase-3的影响，来分析其对黑素瘤细胞的作用机理，为银杏叶提取物诱导肿瘤细胞凋亡的基础研究及临床应用提供实验依据。
　　方法:
　　1、细胞培养将小鼠黑色素瘤B16细胞培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640（不含双抗）培养基中，放置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱内进行常规传代培养。
　　2、该实验分为对照组(药物浓度为0mg/L)及不同浓度银杏叶提取物(EGB)浓度药物组，应用MTT法检测B16细胞加不同浓度的银杏叶提取物(20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L、160 mg/L、320 mg/L)继续培养48小时后，药物对细胞增殖活力的影响，计算相应浓度抑制率及IC50。
　　3、倒置显微镜观察不同浓度EGB处理前及处理48小时后对B16细胞的细胞形态学观察并拍照。
　　4、采用PI染色法用流式细胞仪对B16细胞进行细胞周期分析。
　　5、采用AnnexinⅤ/PI染色法用流式细胞仪对B16细胞进行细胞凋亡分析。
　　6、采用免疫印迹法检测活性Caspase-3蛋白在B16细胞中的表达情况。
　　7、应用统计软件SPSS13.0对数据进行统计分析及处理，以P＜0.05为差异具有显著统计学意义。
　　结果:
　　1、药物作用前的B16细胞呈多角形或菱形，贴壁生长，大小一致，均匀分布，增殖旺盛，未见固缩现象(Fig.1)。
　　2、MTT结果显示，EGB对小鼠黑素瘤B16细胞具有增殖抑制作用，实验组(EGB浓度为20、40、80、160、320mg/L)，培养48h后，OD值分别为0.615±0.026、0.537±0.029、0.414±0.016、0.386±0.012、0.347±0.037;而对照组(EGB为0mg/L) OD值为0.839±0.034，实验组与对照组比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05）;相对抑制率(％):25.18、34.67、50.65、53.99、58.64(Table1，Fig.3)，统计学Logit法计算IC50为87.65mg/L。
　　3、EGB对小鼠B16细胞的细胞分化及形态的影响对照组(0mg/L)处理48小时后在倒置显微镜下观察细胞呈多角形或菱形，贴壁生长且可见层叠现象，大小基本一致，均匀分布，增殖相当旺盛，少见核固缩现象(Fig.2-A);浓度为20mg/L、80mg/L、320mg/L培养48小时后的细胞形态分别可见(Fig.2-B，Fig.2-C，Fig.2-D)，其中浓度为80mg/L、320mg/LEGB作用B16细胞48小时后细胞有显著变化，部分贴壁细胞体积变小、变圆、皱缩、脱落，悬浮细胞增多，可见凋亡小体，随着浓度的增加，上述变化更明显，细胞失去原有的形态结构。
　　4、PI染色法(FCM)结果显示，B16细胞加药(银杏叶提取物浓度20、80、320mg/L)培养48h后，G0/G1期细胞比例明显增高(58.767％±1.143％、69.567％±1.089％、75.700％±0.949％)，与对照组(54.983％±1.087％)比较，组内及组间差异均具有显著性(P＜0.05），而G2/M期(8.533％±0.437％、5.992％±0.270％、4.740％±0.526％)和S期(32.700％±0.965％、24.533％±1.046％、19.617％±1.055％)细胞比例明显地减少，与对照组G2/M期(9.712％±0.668％)(P＜0.05)和S期(35.467％±1.183％)(P＜0.05)相比较，组内及组间差异均有统计学意义(Table2，Fig.4-1，Fig.4-2)。
　　5、AnnexinⅤ/PI染色法(FCM)结果显示，B16细胞加药(EGB浓度20、80、160mg/L)培养48小时后，凋亡率随药物浓度的增加而显著升高，细胞总凋亡率分别为11.7117±1.1929、19.9800±1.9800、25.4200±2.5777，对照组凋亡率为6.2467±0.8676，实验组与对照组及各实验组间相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)(Table3，Fig.5，Fig.6)。
　　6、蛋白质印迹(Western blot)结果显示，B16细胞加药(EGB浓度20、80、320mg/L)培养48小时后，caspase-3蛋白随药物浓度的增加而相应增加，B16细胞内caspase-3蛋白相对表达量依次为0.40±0.03、0.58±0.04、0.69±0.05，对照组为0.33±0.02。实验组与对照组及各实验组间相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)(Table4，Fig.7-A，Fig.7-B)。
　　结论:
　　1、EGB对B16细胞具有明显的增殖抑制作用，导致B16细胞生长阻滞。
　　2、EGB可能使细胞周期阻滞于G0/G1期。
　　3、EGB可能使B16细胞的细胞凋亡率增加。
　　4、EGB可能上调B16细胞内的caspase-3蛋白。
　　5、EGB抑制B16细胞增殖，使细胞周期阻滞及诱导凋亡可能是其抗肿瘤机制之一。因此，为进一步作为单独或辅助药物应用于治疗黑素瘤提供理论基础及实验依据。

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结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 银杏叶提取物的研究现状及应用

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