MTT法体外药敏试验在优化的急性髓系白血病治疗方案中的应用

摘要

目的:多药耐药是急性髓系白血病(AML)治疗失败最主要的因素，克服并逆转耐药是成功治疗复发难治AML的关键所在。异常的DNA甲基化与白血病的发生发展密切相关，因此DNA甲基化成为抗肿瘤药物的良好靶点。DNA甲基转移酶的有效抑制剂地西他滨，对肿瘤细胞具有双重影响，高剂量时可表现出细胞毒作用，加速细胞凋亡，低剂量时可以改变基因的表达模式，促进细胞的分化。目前已经成功用于临床高危MDS、老年AML的治疗。并对复发难治AML的治疗有一定的增敏及逆转耐药的作用。本实验旨在探讨临床治疗AML常用化疗药物的体外药敏实验与临床疗效的关系，探索以地西他滨为主的联合方案作用于耐药髓系白血病细胞及复发难治AML原代细胞的作用机制及疗效，优化治疗方案，指导临床难治性AML治疗。
　　方法:取2014-04至2015-01期间在河北医科大学第二医院住院治疗的48例AML患者骨髓液（初治43例、复发难治5例），所有患者均按临床表现、骨髓形态学检查、免疫学分型和染色体检查符合AML诊断标准（参照张之南，沈悌血液病诊断及疗效标准，第三版，科学出版社）确诊。利用MTT法评价43例AML患者原代细胞对常用化疗药物组合(DNR+Ara-C、THP+ Ara-C、MIT+ Ara-C、IDA+ Ara-C、HHT+ Ara-C)敏感性与临床疗效的相关性。结合白血病预后分层指标能有效地对白血病体内疗效及预后情况进行预测。选取地西他滨、柔红霉素、阿糖胞苷单药或者联合作用对K562/A02耐药细胞株的增殖影响，并通过复发难治AML原代细胞进行验证。所有数据采用GraphPad Prism5.0(San Diego，CA，USA)软件分析。化疗药物的抑制率以(X)±S表示，两组均数比较采用t检验，多组均数间比较采用SNK检验，单因素分析、两个率的比较采用卡方检验。多因素分析采用Logistic回归分析。设定P＜0.05作为具有统计学意义的标准。
　　结果:
　　1、联合用药对初治AML原代细胞抑制率和临床治疗疗效关系
　　1.16种单一化疗药物的IC50值:高三尖杉酯碱0.45μg/ml，米托蒽醌0.88μg/ml，柔红霉素0.49μg/ml，吡柔比星0.36μg/ml，去甲氧柔红霉素0.25μg/ml，阿糖胞苷1.2μg/ml。
　　1.2临床常用5种联合方案对初治AML原代细胞的抑制率:高三尖杉酯碱+阿糖胞苷（HA方案）:敏感组（56.69±9.45）％、耐药组（22.92±2.32）％;米托蒽醌+阿糖胞苷（MA方案）:敏感组（54.21±1.05）％、耐药组(21.38±1.40)％;柔红霉素+阿糖胞苷（DA方案）:敏感组(53.59±11.21)％、耐药组（22.83±1.85）％;吡柔比星+阿糖胞苷（TA方案）:敏感组（53.78±9.57）％、耐药组（21.68±1.66）％;去甲氧柔红霉素+阿糖胞苷（IA方案）:敏感组（60.78±11.28）％、耐药组（21.16±1.68）％。
　　1.343例初治AML患者中，体外敏感者35例，体外耐药8例，体外药敏结果与体内疗效的关系为:S/S32例，S/R3例，R/S1例，R/R7例，总符合率为90.70％，阳性符合率为91.43％，阴性符合率为87.50％，表明体外药敏实验对化疗药物的体内疗效有很好的预测价值。
　　1.4新鲜原代细胞与冻存复苏后细胞抑制率的比较:采用台盼蓝拒染实验统计43例AML患者的新鲜原代细胞及冻存复苏后细胞的细胞活力。新鲜原代细胞的平均活细胞率为（96.69±1.39）％，复苏后平均活细胞率为（79.09±6.02）％，两者比较P=0.000，说明经过复苏后的细胞较新鲜原代细胞活性下降。将各联合用药作用于复苏后的细胞，MTT法测定其细胞生长抑制率，HA方案:敏感组（60.84±8.51）％、耐药组（27.53±1.22）％;MA方案:敏感组（59.23±7.94）％、耐药组（26.53±3.86）％;DA方案:敏感组（59.76±9.12）％、耐药组（27.38±1.31）％;TA方案:敏感组（58.60±8.92）％、耐药组（28.52±1.49）％;IA方案:敏感组（68.38±9.82）％、耐药组（27.21±0.98）％，分别与新鲜原代细胞的抑制率进行比较，P＜0.05，化疗方案作用于新鲜原代细胞与复苏后细胞的抑制率比较差异有统计学意义。43例AML原代细胞复苏后体外药敏实验结果与体内疗效的关系为:S/S32例，S/R10例，R/S1例，R/R0例，总符合率为74.42％。将新鲜原代细胞与复苏后细胞体内外总符合率进行比较，P＜0.05，两者差异具有统计学意义。若将复苏后细胞替代新鲜原代细胞进行体外药敏实验，体内外一致性受到影响，因此本实验均采用新鲜原代细胞。
　　1.5根据体外药敏实验和临床疗效结果分为敏感组(S/S)及耐药组（R/R），按照年龄（≥60岁）、白细胞计数(≥100×109/L)、危险度分层（低危、中危、高危）、是否缓解、是否复发进行单因素分析，结果提示体外实验敏感组体内缓解率高，复发率低，体外实验耐药组体内缓解率低，复发率高，并且白细胞计数、危险度分层与化疗敏感性及疾病复发有关(P＜0.05)。将单因素分析结果有统计学意义的指标进行赋值，并进行Logistic多因素回归分析，结果提示:危险度分层为患者对化疗是否敏感及是否易复发的独立危险因素。
　　2、单药或联合药物对白血病K562/A02耐药细胞株增殖的影响
　　2.1 MTT法检测K562/A02耐药细胞对阿霉素耐药倍数的结果:阿霉素作用于K562/A02细胞24小时的IC50值为12.38μg/ml，作用于K562细胞24小时的IC50值为0.14μg/ml，两样本t检验示，K562/A02细胞对阿霉素的敏感性低于K562细胞(P＜0.05)，K562/A02细胞的耐药倍数是K562细胞的87倍，可继续用于实验。
　　2.2不同浓度单药对K562/A02耐药细胞株增殖的影响:不同浓度地西他滨作用于K562/A02细胞株48h，各组抑制率分别为（19.94±0.12）％、（34.05±0.11）％、（52.23±0.10）％、（60.10±0.07）％，实验结果表明不同浓度地西他滨对K562/A02细胞增殖有抑制作用，且呈剂量依赖性，随着浓度的升高，抑制率逐渐升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。不同浓度柔红霉素作用于K562/A02细胞48h，各组抑制率分别为(6.97±2.32)％、(15.10±1.93)％、(25.11±2.11)％、(30.52±1.76)％。不同浓度阿糖胞苷作用于K562/A02细胞48h各组抑制率分别为(9.20±2.68)％、（19.08±2.11)％、(25.39±1.75)％、(36.15±3.14)％。
　　2.3单药及联合药物对K562/A02耐药细胞株增殖的影响:分别计算出地西他滨的IC50值为0.77μg/ml，柔红霉素的IC50值为7.57μg/ml，阿糖胞苷的IC50值为5.48μg/ml。地西他滨、柔红霉素、阿糖胞苷各单药作用于K562/A02细胞48h抑制率分别为（45.22±2.07）％、（26.82±1.94）％、（22.29±3.01）％。地西他滨+柔红霉素作用于K562/A02细胞48h抑制率为（76.32±1.75）％，地西他滨+阿糖胞苷作用于K562/A02细胞48h抑制率为（79.02±2.30）％，柔红霉素+阿糖胞苷作用于K562/A02细胞48h抑制率为（28.05±1.20）％。地西他滨+柔红霉素处理组较柔红霉素、地西他滨单药处理组均有显著差异(P=0.000)，地西他滨+阿糖胞苷处理组较地西他滨、阿糖胞苷单药处理组均有显著差异（P=0.000），地西他滨+柔红霉素处理组、地西他滨+阿糖胞苷处理组均较柔红霉素+阿糖胞苷处理组有统计学差异（P=0.000）。
　　3、单药或联合用药对复发难治性AML原代细胞增殖的影响
　　3.1单药对复发难治AML原代细胞增殖的影响:地西他滨单药处理5例复发难治性AML原代细胞的抑制率分别为:（40.95±3.42）％、（42.12±2.34）％、(40.91±3.26)％(40.14±3.20)％、(42.56±3.55)％:柔红霉素单药处理的抑制率分别为（20.25±2.84）％、（20.80±3.06）％（21.19±3.57）％、（19.68±3.24）％、（20.87±4.18）％;阿糖胞苷单药处理组的抑制率分别为(17.19±2.97)％、（17.30±3.20）％、（15.30±2.25）％、(17.36±1.72)％、(17.95±2.23)％。
　　3.2地西他滨为主联合药物对复发难治AML原代细胞增殖的影响:地西他滨联合柔红霉素处理5例复发难治AML原代细胞的抑制率分别为:(73.08±1.69)％、(72.80±1.07)％、(73.88±1.71)％、(73.98±1.45)％、（73.15±2.12）％;地西他滨联合阿糖胞苷处理的抑制率分别为:(75.78±3.06)％、(75.56±2.29)％、(74.55±2.87)％、（76.23±2.21)％、（75.66±2.52）％。柔红霉素联合阿糖胞苷处理的抑制率分别为:(27.06±1.82)％、(27.72±1.88)％、(27.70±1.63)％、（26.39±1.27)％、（25.18±2.24）％。地西他滨+柔红霉素处理组均较地西他滨、柔红霉素单药处理组有显著差异(P=0.000)，地西他滨+阿糖胞苷处理组均较地西他滨、阿糖胞苷单药处理组有显著差异(P=0.000)，地西他滨联合药物处理组较柔红霉素+阿糖胞苷处理组有显著差异(P=0.000)。地西他滨、柔红霉素、阿糖胞苷各单药及地西他滨+柔红霉素、地西他滨+阿糖胞苷、柔红霉素+阿糖胞苷联合用药处理K562/A02细胞及难治原代细胞，两样本t检验表明，两种细胞的增殖抑制率存在显著差异(P＜0.01)，说明K562/A02细胞对药物的敏感性高于难治原代细胞。
　　结论:
　　1、体外药敏实验与临床疗效相关性好，对于耐药患者可根据体外药敏实验结果选择最佳化疗方案，调整治疗。
　　2、敏感组(S/S)临床完全缓解率高，复发率低，耐药组(R/R)临床完全缓解率低，复发率高。危险度分层为患者对化疗是否敏感及是否易复发的独立危险因素。
　　3、地西他滨能逆转耐药细胞株K562/A02对阿糖胞苷、柔红霉素的耐药性，同时能逆转复发、难治AML对阿糖胞苷、柔红霉素的耐药性。地西他滨为主的联合化疗方案对于复发难治性AML应用前景良好。

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