硫化氢改善高血压动脉血管内皮功能紊乱的机制研究

摘要

第一部分硫化氢激活 PPARδ/eNOS通路改善高血压患者肾动脉内皮依赖的舒张功能
　　目的：硫化氢（H2S）被证实为第三种气体信号分子，其作为气体调质在心血管系统发挥重要作用，具有改善血管内皮功能紊乱的作用，但是其保护内皮作用的机制目前还远未阐明清楚。过氧化物酶体增殖物激活受体δ（peroxisome proliferators-activated receptorδ，PPARδ）作为核受体家族的一员，在代谢方面发挥的作用已经为大家所熟知。最近的研究发现， PPARδ能够通过激活eNOS/NO通路增强内皮依赖的舒张功能。因此，我们提出假设认为H2S通过激活PPARδ/eNOS通路发挥改善内皮的作用。本研究选取高血压患者和血压正常患者的肾动脉，旨在探讨H2S对PPARδ/eNOS通路的影响，以及是否通过该通路改善高血压患者的内皮舒张功能紊乱。
　　方法：本实验选取罹患高血压或血压正常并行肾切除患者的肾动脉。高血压患者的入选标准为收缩压≥140 mmHg或舒张压≥90 mmHg，不合并糖尿病。入选患者均已签署知情同意书。高血压组和血压正常组的年龄无差异（64.00±2.892岁 vs59.92±2.058岁）。高血压组和正常血压组的肾动脉在加入或不加入硫氢化钠（NaHS，50μmol/ L）的情况下，置于完全DMEM培养基中37℃孵育12 h。孵育后，取肾动脉在器官浴槽中检测乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）诱导的内皮依赖性血管舒张功能。利用Western blot检测血管紧张素受体1（AngiotensinⅡ receptor1，AT1）、胱硫醚-γ-裂解酶（cystathioneγlyase，CSE）、PPARδ、磷酸化内皮型一氧化氮和酶（phosphorylated endothelial nitric oxide synthase，p-eNOS）、p-Akt和p-AMPK等相关蛋白的表达。人脐静脉内皮细胞经过AngII处理后，观察H2S以及各种工具药对一氧化氮（nitric oxide, NO）生成量的影响。应用激光共聚焦显微镜，检测NO探针的荧光强度来反映NO含量。
　　结果：
　　1高血压组肾动脉对 ACh诱导的内皮依赖性的舒张反应性较血压正常组肾动脉明显下降。NaHS慢性孵育高血压患者肾动脉可改善内皮依赖性舒张功能。
　　2高血压组患者的肾动脉 AT1蛋白表达水平显著升高， CSE蛋白表达水平下降。NaHS慢性孵育可下调高血压患者肾动脉AT1受体表达，增加CSE蛋白水平。
　　3高血压组患者肾动脉 PPARδ蛋白表达下调，p-eNOS表达水平降低。NaHS慢性孵育可上调高血压患者肾动脉PPARδ受体表达，提高p-eNOS表达水平。
　　4 NaHS慢性孵育可增加高血压患者肾动脉 p-Akt和 p-AMPK蛋白表达水平。
　　5在培养的人脐静脉内皮细胞中， NaHS可增加血管紧张素 II（angiotensinII，AngII）处理的人脐静脉内皮细胞NO生成量。NaHS促进 NO生成的作用可被 GSK0660（1μmol/L, PPARδ受体阻断剂）、LY294002（5μmol/L, PI3k抑制剂）、Wortmanin（0.1μmol/L, PI3k抑制剂）和 compound C(10μmol/L, AMPKα抑制剂)部分阻断。而应用AT1受体的阻断剂可发挥与NaHS相似的作用。
　　结论：H2S可改善高血压患者内皮依赖性的血管舒张功能，其改善内皮功能的作用可能与改善血管内源性 CSE和 AT1的失衡，以及激活PPARδ/eNOS通路有关。PI3K/Akt和AMPK信号通路可能参与了H2S激活PPARδ/eNOS通路的作用。
　　第二部分硫化氢激活PPARδ改善肾血管性高血压大鼠肾动脉内皮依赖的舒张功能
　　目的：大鼠肾血管性高血压模型是基础研究中常用的高血压模型之一。肾血管性高血压时肾素-血管紧张素系统（Renin-angiotensin system, RAS）的过度激活，最终导致内皮功能受损。本部分研究利用大鼠肾血管性高血压模型，进一步证实H2S通过激活PPARδ通路，改善高血压时动脉内皮以来的舒张功能，并探讨其激活PPARδ的信号转导通路。
　　方法：本实验选用健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，7周龄，190-200克，随机分为四组：Sham组、Sham+NaHS组、2K1C组和2K1C+NaHS组。2K1C和2K1C+NaHS组大鼠行两肾一夹手术制备肾血管性高血压模型。Sham+NaHS和2K1C+NaHS组大鼠于两肾一夹手术或假手术后第三周开始腹腔注射NaHS（56μmol/kg），其余两组于相同时间点腹腔注射生理盐水。每4周通过鼠尾动脉测量动物血压。第20周末利用小动物超声检测肾动脉血流量；各组动物取肾动脉行微血管张力测定，观察内皮和非内皮依赖性血管舒张功能，并且应用PPARδ受体阻断剂GSK0660（1μmol/L）、激动剂GW0742（0.1μmol/L）、AMPKα磷酸化抑制剂（Compound C10μmol/L）、PI3k的抑制剂LY294002（5μmol/L）和Wortmanin（0.1μmol/L）以及NO合酶的抑制剂L-NAME（100μmol/L），通过慢性孵育2K1C组和2K1C+NaHS组大鼠肾动脉观察上述阻断剂对NaHS作用的影响。利用高压液相质谱法测定血浆中H2S含量；利用硝酸盐还原酶法测定血浆中NO含量；HE染色观察肾脏形态学变化；利用Western blot检测PPARδ、CSE、p-eNOS、p-Akt和p-AMPK等蛋白的表达水平。
　　结果：
　　1四组大鼠一般情况监测结果显示：2K1C组和2K1C+NaHS组大鼠体重在术后12周开始出现增长缓慢，并一直持续至实验结束。四组动物的进食量和饮水量无差异，2K1C组的尿量较其他三组动物显著升高。
　　2慢性外源性给予NaHS可显著降低2K1C大鼠的平均动脉压和血浆中AngII水平以及肾动脉AT1受体蛋白表达水平。
　　3慢性外源性给予NaHS可显著降低2K1C大鼠左右肾脏重量比、改善肾功能、减轻肾实质形态学损伤。
　　4慢性外源性给予NaHS可显著增加2K1C大鼠未钳夹侧肾血流量。
　　5慢性外源性给予NaHS可显著改善2K1C大鼠内皮依赖性的血管舒张功能，而对非内皮依赖性的舒张功能无显著影响
　　6慢性外源性给予NaHS可显著升高血浆H2S和NO含量，上调肾动脉CSE蛋白表达水平。
　　7慢性外源性给予NaHS可显著上调2K1C大鼠肾动脉PPARδ和p-eNOS的蛋白表达水平。
　　8慢性外源性给予NaHS可显著上调2K1C大鼠肾动脉p-Akt和p-AMPK的蛋白表达水平。
　　9应用PPARδ受体阻断剂、激动剂，AMPKα磷酸化抑制剂，PI3k的抑制剂，NO合酶的抑制剂，通过慢性孵育2K1C组和2K1C+NaHS组大鼠肾动脉，发现上述阻断剂可部分或全部阻断NaHS的作用。
　　结论：H2S可改善高血压患者内皮依赖性的血管舒张功能，其改善内皮功能的作用可能与改善血管内源性CSE和AT1的失衡，以及激活PPARδ/eNOS通路有关。PI3K/Akt和AMPK信号通路可能参与了H2S激活PPARδ/eNOS通路，并进而改善高血压动脉内皮依赖性血管舒张功能的作用。
　　第三部分硫化氢通过下调 BMP4/COX2的表达改善肾血管性高血压大鼠肾动脉内皮依赖的收缩功能
　　目的：高血压时，内皮功能紊乱一方面表现为内皮依赖的血管舒张功能降低，另一方面表现为内皮依赖的血管收缩功能增强。骨形成蛋白4（ Bone morphogenic protein4，BMP4）属于转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族，主要调节骨骼的胚胎发育和再生修复。最近研究发现，BMP4在心血管系统中发挥重要作用。BMP4通过增加NADPH氧化酶的表达和活性，促进活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）过度生成，进而增加环氧酶2（cyclooxygenase2，COX2）活性，导致前列腺素类物质生成和释放增多，从而损伤血管内皮，增强血管内皮依赖的收缩功能，最终促进高血压形成。已有研究显示，BMP4/COX2表达增加与自发性高血压大鼠内皮依赖性的血管收缩功能增强有关。本研究利用2K1C制备的高血压大鼠模型，旨在观察H2S改善高血压大鼠内皮依赖的血管收缩功能，并观察H2S对BMP4/COX2表达的影响。
　　方法：健康雄性SD大鼠，7周龄，190-200克，随机分为四组：Sham组、Sham+NaHS组、2K1C组和2K1C+NaHS组。2K1C和2K1C+NaHS组大鼠行两肾一夹手术制备肾血管性高血压模型。Sham+NaHS和2K1C+NaHS组大鼠于两肾一夹手术或假手术后第三周开始腹腔注射NaHS（56μmol/kg），其余两组于相同时间点腹腔注射生理盐水。开始应用NaHS后每4周通过鼠尾动脉测量动物血压；第20周末各组动物取肾动脉行微血管张力的测定，观察血管内皮依赖性的收缩功能；利用高压液相质谱法测定血浆中 H2S的含量；利用 Western blot检测 CSE、AT1、BMP4、COX2以及氧化应激相关蛋白的表达水平；利用试剂盒检测SOD活性和MDA含量。
　　结果：
　　12K1C高血压大鼠慢性给予NaHS处理，可显著降低大鼠动脉血压，上调CSE蛋白表达，增加血浆中H2S含量。
　　22K1C大鼠肾动脉内皮依赖性收缩功能显著增强。外源性给予NaHS可改善高血压大鼠内皮依赖性血管收缩功能。
　　3外源性给予 NaHS可显著下调肾血管性高血压大鼠肾动脉中 AT1受体和BMP4的蛋白表达。
　　4外源性给予 NaHS可显著降低肾血管性高血压大鼠体内氧化应激水平，氧化应激相关蛋白NOX2、NOX4、P67、Nitrotysine表达增加。
　　5外源性给予NaHS可显著升高SOD活性，降低MDA含量。
　　6外源性给予NaHS可显著改变p38 MAPK和COX-2的蛋白表达水平。
　　结论：H2S可显著改善高血压大鼠肾动脉血管内皮依赖的收缩功能，其改善内皮功能的作用可能与抑制BMP4/ROS/COX2通路有关。

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引言

第一部分硫化氢通过PPARδ/eNOS通路改善高血压患者内皮功能

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分硫化氢激活PPARδ改善肾血管性高血压大鼠肾动脉内皮依赖的舒张功能

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分硫化氢通过下调BMP4/COX2通路改善肾血管性高血压大鼠血管内皮依赖的收缩功能

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述:硫化氢的心血管保护作用

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