硫化氢改善自发性高血压大鼠肾动脉内皮功能紊乱及其机制研究

摘要

第一部分：硫化氢通过抑制NLRP3/IL-1β通路改善自发性高血压大鼠肾动脉内皮功能
　　目的：原发性高血压往往伴有内皮功能紊乱，可能与体内氧化应激和免疫机制紊乱有关，氧化应激状态下NLRP3炎症小体被激活，而其下游的促炎因子 IL-1β能够直接破坏血管内皮功能。继一氧化碳（CO）、一氧化氮（NO）被发现之后，硫化氢（H2S）作为第三类气体信号分子而被发现，其具有改善血管内皮功能紊乱等多种心血管保护作用，但是作用机制不甚清楚。本部分研究利用SHR高血压模型，在体和离体给予NaSH，以探讨H2S对NLRP3/IL-1β通路和血管内皮功能的影响。
　　方法：
　　1.实验分组：
　　在体实验分为四组，分别为京都Wistar大鼠（Wistar-Kyoto rats，WKY)组， WKY+硫氢化钠（NaSH）组，自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）组，SHR+NaSH组。其中NaSH组动物从8周龄开始，每日腹腔注射给予NaSH100μmol/kg，至24周龄结束。
　　离体实验分为五组，选取24周龄实验大鼠，分别为1）WKY组2）SHR组3） SHR+H2S（100μmol/L）组4） SHR+LPS（10μg/ml）组5） SHR+LPS+H2S组。
　　2.利用鼠尾动脉测压系统测量每组动物的鼠尾动脉收缩压（Systolic blood pressure，SBP），从8周测量至24周，每两周测量一次。
　　3.在体实验在动物满24周后取其两侧肾脏内微动脉二级分支，行微血管环张力测定，测定其内皮依赖的舒张功能和内皮依赖的收缩功能。离体实验无菌分离两侧肾脏内微动脉二级分支，放入培养箱中离体孵育16小时后，行微血管环张力测定，测定其内皮依赖的舒张功能和内皮依赖的收缩功能。
　　4.通过Western blot技术测定肾脏微动脉内H2S生成酶CSE，氧化应激相关蛋白Nrf2，NOX4，P67phox，SOD，CAT，和IL-1β通路蛋白NLRP3，Caspase-1和IL-1β的表达。
　　5.取24周动物血浆，液相色谱-质谱法测量血浆H2S水平；化学法测定血浆丙二醛（MDA）含量；ELISA法测定血浆IL-1β含量。
　　结果：
　　1.在慢性给药结束时，SHR组动物的鼠尾动脉收缩压（SBP）明显高于WKY组，给予NaSH后可以明显降低SHR的血压，具有统计学差异，而对WKY血压几乎无影响。
　　2.SHR血浆 H2S水平和 CSE水平明显降低于WKY组，而给予NaSH后H2S补充了高血压动物内源性硫化氢的不足，上调了CSE酶表达，使H2S水平增加。
　　3.SHR组肾动脉对乙酰胆碱（Ach）诱导的内皮依赖舒张反应性较WKY组明显下降，而内皮依赖的收缩反应显著增强。外源性给予NaSH可以显著改善内皮依赖性舒张功能，抑制过强的内皮依赖收缩反应。离体孵育H2S可显著改善SHR大鼠受损的内皮依赖性血管舒张功能，抑制其内皮依赖性收缩功能，而给予LPS激活NLRP3通路后H2S的这种保护作用被取消。
　　4.SHR肾动脉内的氧化应激蛋白NOX，P67phox水平升高，而抗氧化蛋白Nrf2，SOD，CAT表达下降，慢性给予NaSH可以明显下调氧化蛋白的表达和上调抗氧化蛋白的表达。此外，慢性给予NaSH降低了SHR血浆中氧化应激标志物丙二醛（MDA）的水平。而体外急性给予LPS激活NLRP3通路后H2S的这种抗氧化趋势被取消。
　　5.SHR肾动脉内的NLRP3/caspase-1/IL-1β通路蛋白表达明显增高，慢性给予NaHS可明显下调上述炎症通路的表达。另外，慢性给予NaSH降低了SHR血浆IL-1β水平。体外孵育实验给予LPS过度激活SHR体内的NLRP3通路后，上述蛋白未见明显增加，而再给予NaSH发现其对炎症蛋白的下调作用消失。
　　结论：外源性给予H2S可增强SHR内皮依赖性的血管舒张功能，抑制其过强的内皮依赖的收缩功能，进而降低 SHR血压。H2S这种改善内皮功能的作用可能是通过抑制NLRP3炎症通路，及阻断其与氧化应激之间的相互作用来实现的。
　　第二部分：硫化氢通过上调Nrf2蛋白增强抗氧化能力发挥内皮保护作用
　　目的：核因子红细胞-2相关因子2（Nuclear factor erythroid-2-related factor2，Nrf2）最初认为与红细胞的分化和发育有关，越来越多的研究认为其与氧化应激密切相关。Nrf2是核因子转录家族的成员，在一般情况下处于抑制状态，与分子伴侣Keap-1结合，当细胞受到氧化刺激时，转录因子Nrf2和立刻从Keap1上解离下来并进入细胞核，随后与抗氧化反应元件（ARE）结合，启动抗氧化基因，促进下游抗氧化蛋白的合成。本部分实验旨在讨论 H2S的内皮保护作用是否可以通过上调人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）内的Nrf2蛋白表达，增强细胞的抗氧化能力而实现。
　　方法：
　　1.应用CCK-8法测定HUVECs活性
　　预先半小时向细胞培养基中加入不同梯度浓度 H2S（0μmol/L，50μmol/L，100μmol/L，200μmol/L），AngⅡ1Μm/L刺激6h后观察HUVECs活性的变化。
　　2.HUVECs用慢病毒基因敲除Nrf2，并分为六组：
　　1）阴性对照（Negative control，NC）组
　　2）NC+血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）1μmol/L组
　　3）NC+AngⅡ1μmol/L+H2S100μmol/L组
　　4）Nrf2敲除（Small interferce RNA，siRNA）组
　　5）SiRNA+AngⅡ1μmol/L组
　　6）SiRNA+AngⅡ1μmol/L+H2S100μmol/L组
　　活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平使用DHE染色法测定。Nrf2，SOD，CAT，NOX4，P67phox，NLRP3，Caspase-1，IL-1β的表达经过Western blot法测定。
　　结果：
　　1.AngⅡ可明显降低HUVEC活性，而H2S可以提高HUVECs的生物活性，并且呈剂量依赖性。
　　2.DHE染色发现AngⅡ能明显增加ROS水平，H2S可显著降低ROS水平。基因敲除Nrf2后ROS水平明显增加，且H2S降低ROS的作用被减弱。
　　3.与NC组相比，NC+AngⅡ组和三个SiRNA基因敲除组的Nrf2蛋白表达降低，氧化蛋白NOX4，P67phox表达增加，抗氧化蛋白SOD，CAT表达量减少，在NC组给予H2S后可以上调Nrf2，SOD和CAT的表达，降低氧化蛋白NOX4，P67phox的表达，而在Nrf2被敲除后再给予H2S则这种逆转作用被消除。
　　4.与NC组相比，NC+AngⅡ组和三个SiRNA基因敲除组的NLRP3，Caspase-1，IL-1β表达量增加，在NC组给予H2S后可以下调上述蛋白表达，而在Nrf2被敲除后再给予H2S这种下调作用消失。
　　结论：H2S通过提高Nrf2的表达，增强抗氧化蛋白的表达，降低氧化应激，从而抑制其下游的炎症因子表达,提高内皮细胞活性，来发挥保护内皮细胞和抗高血压的作用。

目录

声明

英文缩写

引言

第一部分硫化氢通过抑制NLRP3/IL-1β通路改善自发性高血压大鼠肾动脉内皮功能

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分硫化氢通过上调Nrf2蛋白增强抗氧化能力发挥内皮保护作用

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述:硫化氢改善血管内皮功能紊乱的机制研究进展

致谢

个人简历