胶质瘤中Kapβ和Ran GTPase介导的FGF2入核机制研究

摘要

成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factors，FGFs)超家族在人和小鼠中共包括22个基因。FGFs通过其受体FGFRs发挥着包括早期胚胎和器官发育等在内的众多生命进程。FGF2又称基础FGF，是FGF超家族成员之一。研究显示FGF2在血管形成和损伤修复中作为一个增生因子而存在，同时越来越多的研究表明FGF2能够作为一个促癌蛋白从而调控肿瘤的发生发展。在人的黑色素瘤中FGF2和FGFR1呈现显著高表达，并且在黑色素瘤细胞体外成瘤试验中，抑制FGF2或者FGFR1的表达能够显著抑制肿瘤的生长。FGF2-FGFR1信号通路的高表达也是小细胞肺癌和胶质瘤等的重要发病诱因。先前的研究表明在超过94％的胶质瘤患者中FGF2 mRNA水平的表达显著上调并且高表达的FGF2能够增加胶质瘤的恶性程度。另外研究提示FGF2具有抗凋亡的特性能够通过上调一些抗凋亡的基因，例如 BCL-2和 B细胞淋巴瘤/白血病-xl基因(B-cell lymphoma/Leukemia-xl, BCL-XL)导致肿瘤细胞的耐药性。
　　在人体中，FGF2有五个亚型(18,22,22.5,24 and34 kDa),分别由FGF2的mRNA选择性翻译而产生。分子量大小为18KDa的FGF2(18K-FGF2)是从经典的Kozak AUG密码子开始翻译的，它包含了155个氨基酸并且是 FGF2的核心区域。剩余的四个亚型被称作高分子量的FGF2(HMW-FGF2)，它们是选择性由CUG密码子转录翻译的。之前的研究显示，HMW-FGF2主要定位在核内，而18K-FGF2则定位在胞浆，并且核内的HMW-FGF2与胶质瘤细胞的增殖能力密切相关。然而，有关不同亚型的FGF2在细胞中分布不同的机制仍然不甚明了。
　　在我们的研究中，我们不仅探讨了HMW-FGF2入核的机制而且证实了核内的HMW-FGF2对胶质瘤细胞系T98G的增殖和存活具有重要影响。HMW-FGF2的入核与核转运蛋白karyopherin家族成员Kapβ2密切相关。同时我们发现 HMW-FGF2的入核还与调控 Kapβ2-入核复合物的 Ran GTPase密切相关，与18K-FGF2过表达组相比，HMW-FGF2过表达能够显著促进胶质瘤细胞系T98G的增殖能力。总体说来，我们的研究首次发现Kapβ2和Ran GTPase调控HWM-FGF2入核的分子机制，并揭示出了该分子机制在胶质瘤的细胞增殖中发挥的重要作用。
　　第一部分18k-FGF2和HMW-FGF2的核定位检测
　　目的：为了探究18k-FGF2和HMW-FGF2在胶质瘤细胞系中的定位，我们构建了18K-FGF2和HMW-FGF2的过表达质粒，并将其转染至胶质瘤细胞系T98G中以探究FGF2在胶质瘤中的定位。
　　方法：
　　质粒构建：
　　将FGF2的cDNA序列(NCBI编号:2247)作为PCR反应的目的模板，使用以下引物扩增HMW-FGF2：
　　正向引物：5’- CCC AGA TCT ATG TAC CCA TAT GAT GTT CCA GAT TAC GCT CTG GGG GAC CGC GGG CGC GGC CGC-3’
　　反向引物：5’-CCC TCT AGA TCA GCT CTT AGC AGA CAT TGG AAG-3’
　　使用如下引物扩增18K-FGF2：
　　正向引物：5’-CCC TCT AGA TCA GCT CTT AGC AGA CAT TGG AAG-3’
　　反向引物：5’-CCC TCT AGA TCA GCT CTT AGC AGA CAT TGG AAG-3’
　　应用 BglII和 XbaI进行酶切并将上述扩增的目的片段克隆到pCMV2载体中。得到的N端HA修饰的HMW-FGF2的氨基酸序列如下：YPYDVPDYA-LGDRGRGRALPGGRLGGRGRGRAPERVGGRGRGRGTA APRAAPAARGSRPGPAGTMAAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPK RLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVC ANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYV ALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS
　　得到的N端修饰的18K-FGF2的氨基酸序列如下：
　　YPYDVPDYA-MAAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGG FFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMK EDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQY KLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS
　　细胞培养：
　　人胶质瘤细胞系 T98G购自美国 ATCC。细胞使用含10%胎牛血清MEM-α培养基进行培养，并置于含5%CO2的37℃恒温培养箱中培养。培养基中无FGF2和EGF的添加。
　　免疫荧光：
　　将T98G细胞接种在玻片上然后转染18K-FGF2或者HMW-FGF2。24h后用PBS清洗后，用4%的多聚甲醛固定45min后终止并通透90min。使用HA一抗孵育90min后用二抗孵育60min。染色后细胞用激光共聚焦进行检测。
　　核浆分离：
　　将T98G细胞用pH为7.4包含5mM磷酸钠、50mM NaCl、150mM蔗糖、5mMKCl、2mM二硫苏糖醇、1mM MgCl2、0.5mM CaCl2、以及0.1%洋地黄皂苷的裂解液裂解，同时将裂解产物刮取下来。加入包含30%蔗糖的核提取缓冲液(2.5mM Tris-HCl, pH7.4,10mM NaCl)，1000g/min离心10min。细胞浆存在于上清液中，而下层为细胞核提取物。
　　蛋白免疫印迹：
　　将细胞用 PBS清洗并用添加蛋白抑制剂的 RIPA裂解液(20mM Tris-HCl, pH7.6,150mM NaCl,1%Triton X-100和2mM PMSF)进行裂解。蛋白浓度用BCA法进行测量和定量。使用25μg总蛋白进行蛋白电泳。
　　结果：我们成功的构建了18K-FGF2和HMW-FGF2 HA修饰的过表达质粒，并通过测序和蛋白免疫印迹检验成功。使用HA抗体进行免疫荧光结果显示HMW-FGF2主要定位于细胞核中，而18K-FGF2则定位在胞浆中。尽管HWM-FGF2有三个区别较为明显的亚型(22,24,34kDa)，然而结果只显示了一种条带较为清楚的FGF2，这是由于N端修饰的HA标签阻遏了从CTGs起始的HMW-FGF2的翻译。这种的特殊的表达方式消除了实验误差以及提供了较好的实验条件。通过蛋白免疫印迹分析分别转染HWM或18K-FGF2的细胞核浆分离产生的蛋白，结果显示几乎所有过表的18K-FGF2都定位在细胞浆中，而HMW-FGF2主要定位在细胞核中，只有少量存在细胞浆中。
　　结论：
　　1在胶质瘤细胞中HMW-FGF2主要定位在细胞核中。
　　218K-FGF2主要定位在细胞浆中。
　　第二部分kapβ2介导的FGF2入核机制
　　目的：包含核定位序列(NLSs)的蛋白的核浆转运往往受到Kapβ的调控，为了探究Kapβ是否参与了包含NLSs序列的HMW-FGF2的入核，我们将 HA-HMW，HA-18K和空载质粒转染进 T98G细胞中并使用蛋白免疫共沉淀分析 Kapβ2和 FGF2的结合关系。为了探究 Kapβ2是HMW-FGF2的核定位所必须的，我们使用了两种不同的Kapβ2 mRNA干扰序列进行沉默 Kapβ2的表达，并使用蛋白免疫共沉淀法进行检验；同时使用核浆分离检测干扰 Kapβ2后对 FGF2在胞浆和核中的定位。由于FGF2信号通路调控了包括细胞增殖在内的多个生物学功能，接着我们探究了FGF2与Kapβ2是否对T98G增殖有影响。
　　方法:
　　RNA干扰：
　　Kapβ2RNA干扰核苷酸由Dharmacon公司合成。将T98G细胞培养在无血清培养基中并用Lipofectamine2000(Invitrogen, USA)进行脂质体转染，转染48小时后进行后续检测。
　　定量PCR检测：
　　使用Trizol(Invitrogen, USA)提取RNA，并使用Promega. SYBR green试剂盒(Thermo Scientific, USA)进行逆转录并进行实时定量PCR检测。基因的表达量用以2-ΔΔCt法进行分析并用GAPDH进行标准化。
　　蛋白免疫共沉淀：
　　转染 FGF2的细胞用 PBS清洗几遍后加入含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液(20mM Tris-HCl, pH7.6,150mM NaCl,1%Triton X-100以及2mM PMSF)。将裂解的蛋白用BCA试剂盒进行定量。按照抗体说明书使用HA抗体结合目的蛋白并在4℃过夜。使用A/G凝胶将HA抗体复合物洗脱下来并离心，在95℃加热变性。将制备的蛋白样品用蛋白免疫印迹进行检测。
　　免疫荧光：
　　将T98G细胞接种在玻片上然后转染18K-FGF2或者HMW-FGF2。24h后用PBS清洗后用4%的多聚甲醛固定45min后终止并通透90min。使用HA一抗孵育90min后用二抗孵育60min。染色后细胞用激光共聚焦进行检测。
　　核浆分离：
　　将T98G细胞用pH为7.4包含5mM磷酸钠、50mM NaCl、150mM蔗糖、5mM KCl、2mM二硫苏糖醇、1mM MgCl2、0.5mM CaCl2、以及0.1%洋地黄皂苷的裂解液裂解，同时将裂解产物刮取下来，加入包含30%蔗糖的核提取缓冲液(2.5mM Tris-HCl, pH7.4,10mM NaCl)，1000g/min离心10min。细胞浆存在于上清液中，而下层为细胞核提取物。
　　MTT分析：
　　为了检测细胞增殖，按照说明书使用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT,Roche, Switzerland)进行检测。将T98G细胞用0.5mg/ml MTT处理并在含5%O2的37℃培养箱中培养，接着使用裂解缓冲液孵育过夜，并在570nm吸收光下进行检测。
　　统计分析：
　　所有结果取自至少五次独立结果，并使用mean±SEM标准化后展示。处理组与对照组的差异使用 t检验进行分析，当 p<0.05时表示具有明显差异。
　　结果：使用 Kapβ2干扰能够实现80%左右的干扰效率并且能够显著抑制Kapβ2的mRNA水平和蛋白水平。使用免疫荧光染色显示干扰Kapβ2等能够抑制核浆转运，并且导致HMW-FGF2的亚细胞分布。对免疫荧光进行统计分析结果显示，HMW-FGF2转染组和对照组相比，核与浆中FGF2的比值为85%和15%，而干扰Kapβ2后则与对照组相比无显著差异，比值分别为50%和49%。核浆分离结果与蛋白免疫荧光结果类似，Kapβ2干扰后HMW-FGF2在核内的表达水平显著下降。细胞增殖实验显示尽管HWM-FGF2和18K-FGF2过表达都能促进细胞增殖，然而 HWM-FGF2过表达促进增殖效果更为明显。HWM-FGF2组在Kapβ2干扰后能够显著抑制其增殖能力，而18K-FGF2过表达组则没有明显变化。
　　结论：
　　1 HMW-FGF2的入核依赖于Kapβ2。
　　2 HMW-FGF2能够通过Kapβ2入核促进T98G增殖。
　　第三部分FGF2入核依赖于Ran GTPase
　　目的：研究显示Kapβ2搬运复合物的核浆转运活性依赖于Ran GTPase核苷酸循环。为了确认Ran GTPase在Kapβ2-HMW-FGF2核转运的重要性，我们使用了GTPγS和 GDPβS处理细胞。GTPγS是无水解酶活性的GTP的类似物，可以使Ran保持在GTP的结合位置。GDPβS也是一种无水解酶活性的GDP的类似物，并能使Ran保持在与GDP结合的位置。为了探究Ran GTPase对Kapβ2-HMW-FGF2促进细胞增殖的作用，我们使用GTPγS和 GDPβS处理细胞，从而探究Ran GTPase对T98G细胞增殖的影响。
　　方法：
　　GDPβS和GTPγS处理：
　　使用HA-HMW-FGF2转染T98G细胞，在转染后将培养基换成含0.1 nM GTPγS、GDPβs或者无菌水作为对照。将细胞放置在37℃进行培养并进行后续细胞提取、核浆分离以及MTT分析。
　　免疫荧光：
　　将T98G细胞接种在玻片上然后转染HMW-FGF2。24h后用PBS清洗后，用4%的多聚甲醛固定45min后终止并通透90min。使用HA一抗孵育90min后，用二抗孵育60min。染色后细胞用激光共聚焦进行检测。
　　核浆分离：
　　将T98G细胞用pH为7.4，包含5mM磷酸钠、50mM NaCl、150mM蔗糖、5mM KCl、2mM二硫苏糖醇、1mM MgCl2、0.5mM CaCl2、以及0.1%洋地黄皂苷的裂解液裂解，同时将裂解产物刮取下来。加入包含30%蔗糖的核提取缓冲液(2.5mM Tris-HCl,pH7.4,10mM NaCl)，1000g/min离心10min。细胞浆存在于上清液中，而下层为细胞核提取物。
　　蛋白免疫共沉淀：
　　转染 FGF2的细胞用 PBS清洗几遍后加入含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液(20mM Tris-HCl, pH7.6,150mM NaCl,1%Triton X-100以及2mM PMSF)。将裂解的蛋白用BCA试剂盒进行定量。按照抗体说明书使用HA抗体结合目的蛋白并在4℃过夜。使用A/G凝胶将HA抗体复合物洗脱下来，离心后95℃加热变性，制备完成上样样品。将制备的蛋白样品用蛋白免疫印迹进行检测。
　　MTT分析：
　　为了检测T98G细胞增殖，按照说明书使用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT,Roche, Switzerland)进行检测。将T98G细胞用0.5 mg/ml MTT处理并在含5%O2的37℃培养箱中培养，接着使用裂解缓冲液孵育过夜，并在570nm吸收光下进行检测。
　　统计分析：
　　所有结果取自至少五次独立结果，并使用mean±SEM标准化后展示。处理组与对照组的差异使用 t检验进行分析，当 p<0.05时表示具有明显差异。
　　结果：使用HA进行免疫荧光结果显示GTPγS和 GDPβS处理后都能够显著阻断HMW-FGF2过表达的T98G细胞中的HMW-FGF2的核聚集。使用蛋白免疫印迹分析核浆分离结果显示， HMW-FGF2过表达的T98G细胞中抑制Ran GTPase活性也能够阻断HMW-FGF2的核转录。蛋白免疫共沉淀结果显示只有GDPβS处理后能够使HMW-FGF2与Ran结合。细胞增殖结果与干扰Kapβ2结果类似；使用GTPγS和GDPβS抑制Ran GTPase的活性以及FGF2核转录后，能够显著降低HMW-FGF2导致的T98G细胞的过度增殖。
　　结论：
　　1 HMW-FGF2入核依赖于Ran GTPase。
　　2 Ran GDP与FGF2结合调控FGF2的浆-核转运。
　　第四部分 FGF2入核激活Akt信号通路
　　目的：为了探讨FGF2对细胞增殖促进作用的机制，我们探究了细胞内主要的调控通路PI3K/AKT信号通路的变化。为了探究是HMW-FGF2入核而不是18K-FGF2对FGF2促进PI3K/AKT信号的作用，我们构建了包含NLSs序列的18K-FGF2质粒并转染入T98G细胞从而探究其功能。
　　方法：
　　免疫荧光：
　　将T98G细胞接种在玻片上然后转染18K-FGF2或者HMW-FGF2。24h后用PBS清洗后用4%的多聚甲醛固定45min后终止并通透90min。使用HA一抗孵育90min后用二抗孵育60min。染色后细胞用激光共聚焦进行检测。
　　核浆分离：
　　将T98G细胞用pH为7.4包含5mM磷酸钠、50mM NaCl、150mM蔗糖、5mMKCl、2mM二硫苏糖醇、1mM MgCl2、0.5 mM CaCl2、以及0.1%洋地黄皂苷的裂解液裂解，同时将裂解产物刮取下来。加入包含30%蔗糖的核提取缓冲液(2.5mM Tris-HCl,pH7.4,10mM NaCl)，1000g/min离心10min。细胞浆存在于上清液中，而下层为细胞核提取物。
　　蛋白免疫共沉淀：
　　转染 FGF2的细胞用 PBS清洗几遍后加入含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液(20mM Tris-HCl, pH7.6,150mM NaCl,1%Triton X-100以及2mM PMSF)。将裂解的蛋白用BCA试剂盒进行定量。按照抗体说明书使用HA抗体结合目的蛋白并在4℃过夜。使用A/G凝胶将HA抗体复合物洗脱下来，离心后95℃加热变性，制备完成蛋白样品。将制备的蛋白样品用蛋白免疫印迹进行检测。
　　MTT分析：
　　为了检测T98G细胞增殖，按照说明书使用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，Roche, Switzerland)进行检测。将T98G细胞用0.5mg/ml MTT处理并在含5% O2的37℃培养箱中培养，接着使用裂解缓冲液孵育过夜，并在570nm吸收光下进行检测。
　　统计分析：
　　所有结果取自至少五次独立结果，并使用mean±SEM标准化后展示。处理组与对照组的差异使用 t检验进行分析，当 p<0.05时表示具有明显差异。
　　结果：过表达18K-FGF2和HMW-FGF2都能够下调PTEN的表达，但是HMW-FGF2下调效果更为明显。过表达FGF2后能够上调p-Akt表达水平，这显示FGF2可能是通过下游的PTEN/p-Akt信号通路发挥促进细胞增殖的作用，同时在HMW-FGF2过表达的T98G细胞中干扰Kapβ2能够抑制p-Akt表达水平。而18K-FGF2添加NLS序列修饰后能够促进其进行入核，并且细胞增殖显示18K-NLS-FGF2过表达的T98G细胞增殖速率明显高于其他 FGF2过表达的细胞系，特别是 HMW-FGF2。蛋白免疫印迹结果显示18K-NLS-FGF2过表达能够显著抑制 PTEN表达并能够提高p-Akt的表达。
　　结论：
　　1核内的HMW-FGF2能够活化p-Akt信号通路。
　　2 NLS序列在HMW-FGF2入核中起了关键作用。

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引言

第一部分18k-FGF2和HMW-FGF2的核定位检测

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分kapβ2介导的FGF2入核机制

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分FGF2入核依赖于Ran GTPase

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第四部分FGF2入核激活Akt信号通路

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述一:恶性胶质瘤诊断和治疗的现状

综述二:FGF2的核定位及其生物学功能

致谢

个人简历