地西他滨联合硼替佐米对套细胞淋巴瘤细胞增殖抑制及其相关机制的研究

摘要

目的:套细胞淋巴瘤（MCL）是一种难治的B细胞非霍奇金淋巴瘤，大多数患者临床侵袭性强，预后差，当前尚缺乏有效的治疗方案。地西他滨(DAC)是临床上最常用的一种去甲基化药物，具有明确的抗肿瘤活性，目前地西他滨对中、高危骨髓增生异常综合征（MDS）及难治性或复发性急性髓系白血病的治疗临床已达成共识，取得较好疗效，但其对MCL的治疗是否有效目前国内外鲜有报道。而硼替佐米（BTZ）是一种蛋白酶体抑制剂，其最主要用于多发性骨髓瘤的一线治疗，近年来研究报道，硼替佐米对复发或难治性MCL和弥漫大B细胞淋巴瘤患者亦发挥明确的抗肿瘤效应，已被 NCCN推荐用于复发或难治性MCL和弥漫大B细胞淋巴瘤患者的治疗，但也仅仅用于二线治疗，仍有一部分患者对其单药治疗疗效不佳。因此，在世界范围内，寻找MCL有效的治疗方法和手段成为当前的研究热点。本研究拟采用体外细胞培养的方法，观察 DAC、BTZ以及两种联合应用对人 MCL细胞株增殖和凋亡的影响，并探讨其相关作用机制，为MCL患者特别是复发难治MCL患者的联合用药治疗提供实验依据。
　　方法：
　　1.用不同浓度的DAC、BTZ在体外对人MCL细胞株 Jeko-1、Grante519细胞进行处理，采用CCK8法检测不同处理因素对细胞的增殖抑制作用。
　　2.采用流式细胞术(Flow cyometry,FCM)检测上述药物处理后对各组细胞凋亡的影响。
　　3.采用RT-PCR法检测上述药物对MCL细胞凋亡和信号传导相关基因PCDH8、NF-Kb、Caspas3、Bcl-2、CCND1、Bax mRNA表达水平的影响。
　　4.采用Western Blot方法检测不同处理因素对MCL细胞中PCDH8、NF-Kb、Caspas3、Bcl-2、CCND1、Bax蛋白表达水平的影响。
　　结果：
　　1.低浓度的DAC（0.1、1、10μmol/L）能明显抑制Jeko-1、Grante519细胞增殖并诱导其凋亡，其抑制效应呈剂量依赖和时间依赖性；经单药DAC处理后，在Jeko-1、Grante519细胞中均可观察到Caspase3、Bax表达水平的升高，Bcl-2、CCND1表达水平的降低，但NF-KB（P65）表达水平在各组之间则无明显差异；因PCDH8启动子区域过甲基化导致其表达水平减低的Jeko-1细胞，经DAC处理后，Jeko-1细胞中PCDH8表达水平明显升高，证实去甲基化治疗有效；
　　2.高浓度的BTZ（0.2、0.4μmol/L）能明显抑制Jeko-1、Grante519细胞增殖并诱导其凋亡，其抑制效应呈剂量依赖和时间依赖性；单药BTZ均能引起Jeko-1、Grante519细胞中Caspase3、Bax表达水平的升高，NF-KB（P65）、Bcl-2、CCDN1表达水平降低，但对PCDH8表达水平无明显影响；
　　3.DAC联合BTZ使Jeko-1、Grante519细胞的抑制率、凋亡率明显增加；且DAC对Jeko-1、Grante519细胞的增殖抑制及促凋亡作用大于BTZ；与对照组及单药处理组相比，DAC联合BTZ作用后能显著提高Jeko-1、Grante519细胞PCDH8、Caspase3、Bax表达水平，相反显著降低NF-KB（P65）、Bcl-2、CCND1表达水平。
　　结论：
　　1.DAC在一定浓度范围内对Jeko-1、Grante519细胞具有增殖抑制及促凋亡作用，其作用呈时间和剂量依赖性；其作用机制可能与DAC的去甲基化作用和细胞毒作用有关；并且DAC能够通过上调Caspase3、Bax表达水平，以及降低Bcl-2、CCND1的表达水平，以进一步调控细胞增殖及凋亡过程，从而发挥明显的抗肿瘤活性。
　　2.在一定浓度范围内BTZ可以增强Jeko-1、Grante519细胞的增殖抑制作用及促凋亡作用；其作用机制可能与BTZ能够降低NF-KB信号通路活性，上调Caspase3、Bax表达水平，减低Bcl-2、CCND1表达水平，从而达到促进细胞凋亡，抑制细胞增殖的作用。
　　3.低浓度DAC具有去甲基化作用，高浓度DAC具有细胞毒性作用。
　　4.DAC与BTZ具有正协同作用，其对MCL细胞的增殖抑制作用可能是两药联合后加强了对NF-KB信号通路的抑制作用，并且下调 Bcl-2水平，上调Bax水平，从而引起下游的Caspase3蛋白表达水平进一步升高，以达到更高的抗肿瘤作用。这一实验结果可能为今后临床应用DAC联合BTZ治疗MCL提高新的理论依据。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

3 统计学处理

结果

1 DAC、BTZ对Jeko-1、Grante519细胞增殖活性的影响：

2 DAC、BTZ对Jeko-1、Grante519细胞凋亡的影响：

3 DAC、BTZ对Jeko-1、Grante519细胞中PCDH8、Bcl-2、CCND1、Bax、NF-KB（P65）、Caspase3蛋白表达的影响：

4 DAC、BTZ对Jeko-1、Grante519细胞中PCDH8、Bcl-2、CCND1、Bax、NF-KB（P65）、Caspase3 mRNA表达的影响：

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:SOX11对套细胞淋巴瘤诊断及预后意义的研究

致谢

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