肿瘤组织SNP突变分析及其MPS技术应用初探

摘要

目的：肿瘤组织样本是法医检案中常会遇到的一类特殊的疑难生物检材，其本身具有基因突变的特性，且大部分都是经过福尔马林固定石蜡包埋保存，极易发生DNA降解。而法医学常规检验的STR在肿瘤组织突变率较高，且扩增片段较长容易发生等位基因丢失，使得传统毛细管电泳检测STR方法已不再适用于肿瘤组织的检测。与STR相比，SNP突变率较低，扩增片段短。因此，本研究旨在探讨肿瘤组织的SNP突变规律，继而比较福尔马林固定的降解肿瘤组织的SNP与STR的检出率，并初步探索二代测序技术在检测肿瘤组织中的应用价值，为法医检案中检验肿瘤组织选择遗传标记以及检测技术提供基础实验依据。
　　方法：
　　1.样本采集：本实验中所使用的样本为本室保存的124例肿瘤组织，包括85例消化道系统、16例泌尿系统、13例呼吸系统、10例头颈部的肿瘤组织及癌旁正常组织。所用的24例降解样本是福尔马林固定、-20℃保存五年的组织提取的DNA，包括12例消化道系统肿瘤组织及其癌旁正常组织。
　　2.DNA提取：用石蜡包埋组织DNA提取试剂盒提取上述124例肿瘤组织及正常组织DNA，采用ND-1000蛋白核酸定量仪定量。用GeneReadTM DNA FFPE试剂盒提取24例经福尔马林固定的组织样本 DNA，采用Quantifiler Trio DNA定量试剂盒在7500实时荧光定量PCR仪上进行定量，得到样本浓度及降解系数。
　　3.SNP分型：采用55个SNPs SNaPshot复合分型体系进行SNP分型， ABI3130基因分析仪电泳，使用GeneMapper ID v3.2软件分析结果，得到肿瘤组织、正常组织的SNP分型。比对来自同一个体的正常组织和肿瘤组织的SNP分型结果，记录突变的位点和突变类型。
　　4.SNP突变位点验证：采用单位点扩增SNaPshot、Sanger测序方法对突变位点进行验证。
　　5.STR分型：采用PowerPlex 21试剂盒扩增降解样本的20个常染色体STR基因座，ABI3130基因分析仪进行电泳，使用GeneMapper ID v3.2软件分析结果，得到24例降解样本的STR分型。
　　6.STR单个基因座检测：对疑似突变的STR基因座采用单个STR基因座进行PCR扩增，用聚丙烯酰氨凝胶电泳进行检测。
　　7.Miseq FGx测序：采用ForenSeqTM DNA Signature Prep试剂盒（DNA引物混合液A）在Miseq FGx测序平台对24例降解样本进行测序，包括27个常染色体STR、24个Y-STR、7个X-STR、94个个体识别SNP，用ForenSeqTMUAS V1.2.16347法医分析软件进行数据分析。
　　8.统计学分析：应用Excel、SPSS v21.0软件对上述实验结果进行统计学分析，用χ2检验比较消化道肿瘤与其他类型肿瘤之间SNP突变的差异。用直线相关对 STR基因座片段大小与等位基因检出率、样本降解系数与等位基因检出率进行相关性分析。用均数和标准差对Miseq FGx测序结果中STR与SNP的平均测序深度、平均杂合比值、基因座的构成比进行统计学描述。用秩和检验和t检验比较降解的肿瘤样本和降解的正常样本之间STR与SNP测序深度、杂合比值、基因座构成比的差异。用直线相关分析方法分析STR和SNP测序深度与片段长度、测序深度与样本降解系数的相关性。
　　结果：
　　1.肿瘤组织的SNP突变分析。85例消化道肿瘤样本、16例泌尿系统肿瘤样本、13例呼吸系统肿瘤样本、10例头颈部肿瘤样本经SNaPshot复合分型体系分型后，共发现49个疑似突变位点。之后对49个位点进行了单位点SNaPshot验证，结果显示共3例样本4个位点发生了突变，1例消化道肿瘤样本的（rs9905977：C/T→T，rs722290：C/G→G），2例泌尿系统肿瘤样本（rs7041158：C/T→C）（rs10092491：C/T→C），均表现为杂合性丢失。对四个位点进行Sanger测序验证，1例泌尿系统肿瘤样本rs7041158测序失败，其余三个位点测序成功，均表现为杂合性丢失，与单位点SNaPshot验证结果一致。用χ2检验对消化道肿瘤与其他类型肿瘤的SNP突变率差异进行比较分析，无统计学差异。对肿瘤组织 SNP突变率与本实验室前期检测的STR突变率进行比较，在样本与基因座水平 SNP突变率均明显低于STR突变率，具有统计学差异。
　　2.降解组织SNP与STR检出率比较。采用Quantifiler Trio DNA定量试剂盒在7500实时荧光定量PCR仪上对24例福尔马林固定存放五年的组织样本 DNA的降解系数及浓度进行检测。检测结果显示，除1例样本的降解系数小于1外，其余23例样本降解系数范围为1.01~8.57，发生不同程度的降解。此24例存放五年的组织样本与其在福尔马林固定24小时内提取的DNA检测结果相比，SNP分型完全一致，检出率为100％；而STR检测结果显示共发生13个基因座等位基因完全丢失，7个基因座发生等位基因杂合性丢失，这些发生等位基因丢失的样本大部分降解较严重，降解系数大于2.6，且75.8%丢失等位基因的片段长度大于300bp。对STR基因座片段长度与等位基因检出率之间进行相关性分析，呈负相关，随着检测片段长度增长，STR基因座检出率逐渐下降。除两例样本降解系数较小却发生等位基因丢失外，其余样本降解系数与等位基因检出率之间呈负相关，即DNA样本降解系数越大，STR等位基因检出率越低。
　　3.Miseq FGx测序结果分析。12例降解的肿瘤样本STR基因座（Amel除外）平均测序深度为2384×（±1884×），平均杂合比值为0.61（±0.13），等位基因所占比例为0.92（0.81~1.00），stutter所占比例为0.06（0.00~0.13），noise所占比例为0.02（0.00~0.07）。12例降解的正常样本STR基因座（Amel除外）平均测序深度为2158×（±1710×），平均杂合比值0.73（±0.11），等位基因所占比例为0.92（0.81~1.00），stutter所占比例为0.06（0.00~0.13），noise所占比例为0.02（0.00~0.07）。降解的肿瘤样本和降解的正常样本在STR基因座平均测序深度、等位基因、stutter、noise所占比例均无统计学差异，而正常样本的基因座平均杂合比值高于肿瘤样本，具有统计学差异。降解的肿瘤样本和降解的正常样本STR基因座平均测序深度与基因座片段长度之间呈负相关，即随着基因座片段长度增加， STR基因座平均测序深度降低。降解的肿瘤样本样本STR测序深度与样本降解系数之间无相关性，降解正常样本样本 STR测序深度与样本降解系数之间呈负相关。
　　12例降解的肿瘤样本SNP位点平均测序深度741×（±661×），平均杂合比值0.61（±0.12），等位基因所占比例为0.9998（0.9925~1.0000）， noise所占比例为0.0002（0.0000~0.0075）。12例降解的正常样本SNP位点平均测序深度633×（±552×），平均杂合比值0.77（±0.12），等位基因所占比例为0.9995（0.9892~1.0000）， noise所占比例为0.0005（0.0000~0.0108）。降解的肿瘤样本和降解的正常样本SNP位点平均测序深度无统计学差异。SNP位点平均杂合比值、SNP位点等位基因、noise所占比例均有统计学差异。降解的肿瘤样本和降解的正常样本SNP位点平均测序深度与SNP位点片段长度之间呈负相关，即随着SNP位点片段长度增加，SNP位点平均测序深度降低。样本SNP测序深度与样本降解系数之间无相关性。
　　24例降解样本在Miseq测序平台与CE平台检测的PowerPlex 21试剂盒进行STR一致性研究。结果显示除16例样本共24个基因座分型结果不一致外，其余基因座检测结果一致。有21个基因座检测出基因亚型，3个基因座比CE多检测出一个新的等位基因。针对降解DNA，Miseq测序平台和CE检测均显示有大片段等位基因丢失现象，二者的等位基因检出率无统计学差异。Miseq检测中有Penta E和D12S391两个基因座共30个等位基因丢失，主要表现为Penta E等位基因丢失，占未检出等位基因的93.33%，其片段长度为362bp~467bp。CE检测中有11个基因座共33个等位基因丢失，75.8%丢失等位基因的片段长度大于300bp。
　　24例降解样本进行55个SNPs的SNaPshot复合分型和Miseq测序平台进行SNP一致性研究，两个试剂盒共有43个相同位点。比较两种方法的结果显示共有5个SNPs的分型不一致，其中2个SNPs的SNaPshot分型结果丢失一个等位基因，3个SNPs的Miseq检测结果丢失一个等位基因。两种方法的等位基因检出率无统计学差异。
　　结论：
　　1.肿瘤组织SNP的突变率明显低于STR，SNP更适合于肿瘤组织的个体识别和亲缘鉴定。
　　2.长期福尔马林固定的组织易发生降解，SNP比STR在降解肿瘤组织检验中更具优势。
　　3.与SNPs SNaPshot分析方法相比，Miseq FGx测序平台对于肿瘤样本和降解检材的检测显示出了更高的灵敏度，测序数据具有一定准确性和可靠性，可以作为肿瘤样本检测时的一个有效方法。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1 材料

2 实验方法

3 数据处理及统计学分析

结果

1 肿瘤组织的SNP突变分析

2 福尔马林固定组织样本SNP与STR检出率比较

3 Miseq FGx测序结果分析

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:疑难检材法医学检验的研究进展

致谢

个人简历