乳腺癌及妇科肿瘤组织常染色体SNP突变分析

摘要

目的：在法医日常司法鉴定实践活动中，除了常见的血液、血痕、毛发、唾液等检材外，还有一类特殊的检材，即肿瘤组织，在某些特定情况下可能成为检案唯一的参照样本。与STR相比，SNP具有突变率低和易于检测等特点，从而对于肿瘤组织身源认定具有潜在的应用价值。但是目前国内外尚缺乏对肿瘤组织 SNP稳定性的系统研究。本研究旨在探讨妇科肿瘤组织和乳腺癌组织的SNP突变规律，并分析肿瘤类型、组织类型、分化程度、临床分期对SNP突变率的影响，以系统评估SNP对该两种肿瘤组织的法医学检验的实际应用价值，并探索应对肿瘤来源生物学检材的高效、准确的SNP分型方法，以期对此类案件的法医学检验提供参考。
　　方法：
　　1样本采集：本实验中所使用样本为本科室前期采集的63例乳腺癌和62例妇科恶性肿瘤患者的肿瘤组织和癌旁正常组织，以及10例妇科良性肿瘤组织及正常对照组织。相应地包括患者的年龄、肿瘤类型、组织类型、临床分期、分化程度等信息。
　　2 DNA提取：分别用动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒和石蜡包埋组织DNA提取试剂盒提取妇科肿瘤和乳腺癌的肿瘤组织、癌旁正常组织DNA，采用ND-1000蛋白核酸定量仪定量。
　　3 SNP分型：采用SNapShot multiplex kit试剂盒扩增肿瘤组织及正常组织DNA的55个常染色体SNP基因座；然后进行PCR反应产物纯化、单碱基延伸反应、单碱基延伸反应产物纯化、ABI3130基因分析仪对单碱基延伸反应纯化产物进行电泳分型，使用GeneMapper?v3.2软件分析结果，得到肿瘤组织、正常组织的 SNP分型。比对来自同一个体的正常组织和肿瘤组织的SNP分型结果，记录突变的位点和类型。
　　4等位基因特异性PCR扩增（AS-PCR）
　　4.1 AS-PCR引物设计：从55个SNP位点中选择18个基因座，其中9个为检测到突变的基因座，9个为未检测到突变的基因座。根据http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/网站公布的参考序列，结合引物设计软件Primer Premier6.0和oligo7.0，以及NCBI blast比对结果，对选取的18个SNP基因座重新设计AS-PCR的两条等位基因特异性引物和一条通用引物。为增加引物的特异性，在两条等位基因特异性引物中均额外引入一个错配碱基；此外，在其中一条等位基因特异性引物5＇端加入一段与模板DNA不配对的核苷酸序列，将SNP序列差异转换为长度差异，便于后续毛细管电泳检测。
　　4.2单位点等位基因特异性PCR扩增：为验证单位点AS-PCR分型体系的准确性，选取4例已知 SNP分型的健康个体 DNA样本，分别采用Q5超保真 DNA聚合酶和 AmpliTaq Gold DNA聚合酶对其 DNA进行AS-PCR，产物经ABI3130基因分析仪进行检测，Data Collection V3.0软件采集数据，Genemapper V3.2软件分析数据得到SNP分型。
　　5 SNP突变验证：采取多次重复SNapShot实验、单等位基因Sanger测序、单位点AS-PCR对部分突变位点进行验证。
　　6统计学分析：应用Excel、SPSS v21.0软件对上述实验结果进行统计学分析，用χ2检验分别比较妇科肿瘤和乳腺癌不同肿瘤类型、组织类型、分化程度的 SNP突变差异；用秩和检验分别比较两种肿瘤不同临床分期的SNP突变差异；用χ2检验比较妇科肿瘤与乳腺癌组织之间SNP突变率的差异。
　　结果：
　　1 AS-PCR体系构建及准确性验证
　　设计了18个SNPs位点的AS-PCR引物，引物长度18~32个碱基，扩增产物长度107~217bp。见Table1。4例已知SNP分型的DNA样本经AS-PCR，结果显示Q5超保真DNA聚合酶得到的SNP分型存在非特异性扩增，与已知分型均不一致；而AmpliTaq Gold DNA聚合酶得到的SNP分型结果与已知分型完全一致，结果正确。
　　选取六个 SNP位点的等位基因进行 Sanger测序，其中 rs1109037、rs740598、 rs10092491测序失败，其余三个位点rs2342747、rs6444724、rs159606的等位基因序列与NCBI网站提供的标准序列一致，验证了所构建的AS-PCR分型体系的准确性。
　　2妇科肿瘤组织的SNP突变
　　10例妇科良性肿瘤组织未检出突变；62例妇科恶性肿瘤组织经SNapShot方法分型后，共发现5例样本的五个SNP位点发生了突变，突变类型表现为杂合性丢失，包括9号样本和29号样本的rs13218440、16号样本的rs1523537、18号样本的rs1498553和28号样本的rs315791。选取9号、18号、29号样本进行AS-PCR，并对9号、18号、28号、29号肿瘤组织 DNA进行 Sanger测序。16号样本的 rs1523537位点三次SNapShot分型结果一致，故未采用其它方法进行验证。综合上述三种方法的实验结果，确定有3例（9号、16号、28号）妇科肿瘤组织共3个SNP（rs13218440、rs1523537、rs315791）存在突变，突变类型均为等位基因杂合性丢失。比较良、恶性妇科肿瘤组织 SNP突变率，其差异无统计学意义（P>0.05）。经过χ2检验分别比较妇科三种不同肿瘤类型、组织类型、分化程度的 SNP突变率，均未发现统计学差异。经秩和检验结果显示，妇科肿瘤组织不同临床分期的 SNP突变率亦无统计学差异。比较妇科肿瘤组织SNP与本实验室前期STR检测结果，在样本及基因座水平SNP突变率均显著低于STR突变率（P<0.05）。
　　3乳腺癌的SNP突变
　　63例乳腺癌样本经SNapShot方法分型后，共三对样本26个SNP位点发生了突变，包括2号的rs445251、40号的rs2270529和7号的24个SNP位点。选取了7号样本的15个SNP位点进行Sanger测序，以及7个SNP位点进行AS-PCR验证。综合分析实验结果，确定上述3例乳腺癌样本共21个SNP位点存在突变，其中15个SNP位点突变类型为等位基因杂合性丢失，2个为纯合子突变为杂合子（rs1478829：T→T/A， rs1821380：C→G/C）,3个为SNP位点转换（rs8078417：A→G，rs338882：C→T，rs1027895：C→T），1个为SNP位点颠换（rs10776839：A→C）。经秩和检验结果显示，乳腺肿瘤组织不同临床分期的 SNP突变率无统计学差异。经χ2检验结果显示，中高分化和低分化乳腺癌组织的个体 SNP突变无统计学差异。比较乳腺癌SNP与本实验室前期STR检测结果，在样本及基因座水平SNP突变率均显著低于STR突变率（P<0.05）。
　　4妇科与乳腺肿瘤的SNP突变比较：经χ2检验，妇科肿瘤组织与乳腺癌在个体水平SNP突变率无统计学差异，而乳腺癌的SNP突变位点数显著多于妇科肿瘤组织（P＜0.05）。
　　结论：
　　1在乳腺癌和妇科肿瘤组织SNP突变率低于STR，有望筛选到稳定的SNP体系应用于肿瘤组织身源鉴定。
　　2 AS-PCR对肿瘤组织SNP分型准确、方法简便，为法医物证检验提供一种有效的检测方法。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

英文缩写

前言

材料与方法

1 材料

2 实验方法

3 数据处理及统计学分析

结果

1 AS-PCR体系构建及准确性验证

2妇科肿瘤组织的SNP突变

3 乳腺肿瘤组织的SNP突变

4 妇科与乳腺肿瘤的SNP突变率比较

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述: 肿瘤组织SNP的检测及相关方法

致谢

个人简历