肿瘤相关性microRNA结合位点单核苷酸多态性与乳腺癌发病风险的关系

摘要

目的：
　　乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。近年来在全世界范围内，乳腺癌患者发病年龄呈低龄化，发病率呈上升趋向。其中，5-10％的乳腺癌患者属于家族性乳腺癌，而乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2基因突变只能解释20-25%的家族性乳腺癌病因。MicroRNA(miRNA)是一种小型非编码RNA，长度约为19-25个核苷酸。大部分基因的转录过程都受到miRNA的调控。通过这些调控，miRNA在生物体发育、细胞增殖、分化、凋亡、应激等过程中发挥着至关重要的作用。MiRNA结合位点单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNP)指的是miRNA与目的mRNA在3'端非翻译区（3'untranslated region,3'UTR）的结合位点发生单个核苷酸在基因组水平上的变异，从而造成该结合位点的DNA序列多态性。其可调控miRNA与目的基因的表达，进而影响到恶性肿瘤的发生风险、治疗反应及预后效果。本研究分别对RYR3(rs1044129),KIAA0423(rs1053667),C14orf101(rs4901706),GOLGA7(rs11337),KRT81(rs3660)五个miRNA结合位点的SNP进行测序分析，结合病例-对照研究，寻找与散发性及家族性乳腺癌发生风险相关的特异SNP位点，并更深入探寻该位点与乳腺癌患者临床病理特征之间的关系。
　　方法：
　　1.研究对象：乳腺癌组患者为2013年1月~2016年3月间，在河北省肿瘤医院乳腺中心住院的患者，经穿刺、术后病理确诊为乳腺癌。其中，散发乳腺癌组152例抗凝静脉血标本，家族乳腺癌组30例抗凝静脉血标本，都取自乳腺癌患者术前静脉血样；对照组的130例抗凝静脉血标本，都取自2013年10月~2016年10月间，在河北省肿瘤医院体检的正常人，具有详细的体检资料，并除外与乳腺癌相关的疾病。
　　2.基因组DNA提取：用血液基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）(北京天根生化科技有限公司)提取静脉血标本的基因组DNA，提取后放在-80℃恒温冰箱中保存备用。
　　3.标本DNA的扩增及SNP筛查：根据NCBI数据库中五个miRNA结合位点对应的目的基因片段，来设计PCR扩增引物，然后根据PCR预混试剂盒扩增，得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳证实后再送往上海捷瑞生物工程技术服务有限公司。该公司使用聚合酶链反应-连接酶检测反应(Polymerase Chain Reaction-ligase detection reaction，PCR-LDR)方法对RYR3(rs1044129),KIAA0423(rs1053667),C14orf101(rs4901706),GOLGA7(rs11337), KRT81(rs3660)的SNP位点进一步分析。
　　4.统计分析：采用t检验(student t-test)比较计量资料。采用χ2检验对散发性及家族性乳腺癌组和对照组的RYR3(rs1044129),KIAA0423(rs1053667),C14orf101(rs4901706),GOLGA7(rs11337),KRT81(rs3660)的SNP位点基因型频率进行分析。采用χ2检验对有意义的SNP位点基因型频率对乳腺癌患者临床病理学特征影响的分析。
　　所得到的数据都采用SPSS21.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)统计软件进行统计分析，认为P<0.05时有统计学意义。
　　结果：
　　1.对散发性及家族性乳腺癌组与对照组的年龄进行比较，结果显示散发性乳腺癌组与对照组的年龄(t=-1.215,P=0.225)、家族性乳腺癌组与对照组的年龄(t=1.058,P=0.292)差异均无统计学意义（P>0.05），说明散发性及家族性乳腺癌组与对照组之间年龄均衡。
　　2.对五个基因结合位点的SNP分布频率分析显示，在散发性乳腺癌组与对照组之间，rs1044129、rs1053667、rs4901706、rs11337多态性位点进行各组间比较，发现此四个位点SNP分布频率无明显差异。而对于KRT81基因的多态位点rs3660，GG、CG+CC基因型在散发性乳腺癌组中出现的频率是70.4%和29.6%，而在对照组中出现的频率为42.9%和57.1%，rs3660位点GG基因型携带者相对CG+CC基因型携带者发病风险为5.548倍(odds ratio,5.548;95%CI,3.326-9.256;P=0.000)。
　　3.在家族性乳腺癌组与对照组之间，对于KRT81基因的多态位点rs3660，GG、CG+CC基因型在家族性乳腺癌组中出现的频率是60.0%和40.0%，而在对照组中出现的频率为42.9%和57.1%，家族性乳腺癌患者中rs3660位点GG基因型携带者相对CG+CC基因型携带者发病风险为3.497倍(odds ratio,3.497;95%CI,1.541-7.937;P=0.002)。除了KRT81基因的多态位点rs3660存在差异之外，对于RYR3基因的多态位点rs1044129，AA、AG+GG基因型在家族性乳腺癌组中出现的频率是63.3%和26.7%，而在对照组中出现的频率为41.5%和58.5%，对于rs1044129位点AA基因型携带者相对AG+GG基因型携带者发病风险为2.431倍(odds ratio,2.431;95%CI,1.070-5.522;P=0.031)。而rs1053667、rs4901706、rs11337这三个位点SNP分布频率无明显差异。
　　4.在KRT81(rs3660)的SNP位点基因型对乳腺癌患者临床病理学特征影响的分析中，GG型与CG+CC型乳腺癌患者在原发肿块大小、淋巴结转移情况、肿瘤病理学类型、AJCC分期、免疫组化表达及分子分型等方面均无明显差异。
　　结论：
　　1.在散发乳腺癌组及家族性乳腺癌组与对照组之间，KRT81基因的多态位点rs3660的SNP分布频率存在差异，此位点可能是与乳腺癌发生相关的SNP位点。
　　2.在家族性乳腺癌组与对照组之间，除了在KRT81基因的多态位点rs3660存在差异，RYR3基因的多态位点rs1044129的SNP分布频率也存在差异，此位点可能是家族性乳腺癌发生相关的SNP位点。
　　3.尚不能认为KRT81基因的多态位点rs3660基因型分布频率与乳腺癌患者的临床病理特征（AJCC分期、病理类型、免疫组化表达情况、分子分型等）有相关性。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1 研究对象

2 实验方法

3 统计学处理

结果

2 miRNA结合位点SNPs分布频率分析

3 KRT81基因rs3660位点SNP基因型对乳腺癌患者临床病理特征的影响分析

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:MicroRNA与乳腺癌关系的研究进展

致谢

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