microRNA结合位点单核苷酸多态性对肝细胞癌预后影响的相关性研究

摘要

肝细胞癌(HCC)是全球发病率排名第五的一种常见恶性肿瘤，每年超过五十万人死于 HCC，它也是世界上死亡发生率位列癌症第三的肿瘤，严重威胁着人们的身体健康。流行病学及实验研究资料表明，HCC与许多危险因素密切相关，包括慢性乙型肝炎病毒和慢性丙型肝炎病毒感染、酗酒、亚硝胺类物质、黄曲霉素、肝硬化、饮水污染、微量元素、性激素等都与 HCC发病明显相关。由于 HCC发生的分子机制尚不完全清楚，尽管临床检测方法和治疗手段不断的改进与发展，但是化疗及术后HCC患者的预后仍然很差，复发率高，其中有许多影响预后的相关因素，包括肿瘤大小，肿瘤数量，细胞分化，对静脉血管侵袭及炎症程度等。恶性肿瘤是在多个危险因素的共同作用下，导致人体组织细胞分裂、增生、凋亡等调控异常而形成的一种新生物。基因组表达的不稳定性是恶性肿瘤发病的基本特征之一，基因组的缺失或扩增常常在恶性肿瘤的发生、发展过程中出现，这些基因组的改变可导致抑癌基因的失活或癌基因的激活，使人体细胞出现重大的改变。大约有50％的微小核糖核酸(microRNAs, miRNAs)基因位于与恶性肿瘤相关的脆性位点或基因组区域，它们和正常人体组织细胞miRNA的表达有明显差异，不同组织来源的肿瘤细胞系中的miRNA的调控作用及含量也会明显不同。miRNAs是近年来发现的一类由22个核苷酸组成，可以通过与信使核糖核酸(messenger RNA, mRNA)3′非编码区(3'-untranslated region,3'UTR)碱基互补结合，导致其目的蛋白翻译受到抑制，发挥其转录后调节器的作用。具体来说，miRNA的目标核苷酸位于mRNA的5'端，也被称为mRNA3'UTR的种子区域。miRNA与其相应mRNA序列的互补结合导致mRNA沉默并进而促使目的蛋白表达水平的下降，可以影响细胞发育、分化、增殖、凋亡等多种生物学过程。miRNA是一个细胞功能和细胞程序的调控阀门，不仅能调节多种蛋白质的表达，还能影响多个信号通路的信号传导，对恶性肿瘤的发生发展过程具有调控枢纽作用。近年来许多学者越来越重视miRNA相关等位基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)的研究。SNPs是指单个核苷酸在染色体水平上变异而引起的基因组序列多态性，这些变异包括核苷酸的置换、缺失和插入等改变。SNPs广泛存在于人类基因组中，平均每500~1000个碱基就会出现一个，占所有已知基因多态性类型的90%以上，是人类最常见的一种可遗传变异。随着对人类全基因组大规模扫描结果显示， miRNA结合位点上的SNPs约有20000个。它既具有遗传标记作用，还可以通过调控基因表达导致疾病易感性的差异。越来越多的证据表明，位于3'UTR的miRNA结合位点SNPs可以通过miRNA改变目的基因的表达，从而增加个体罹患癌症的风险。miRNA及其结合位点SNPs对HCC的发病易感性，肿瘤细胞的转移，疾病的自然转归及术后预后有明显的影响，而且部分SNPs可以抑制肿瘤细胞增殖，对机体有保护作用。miRNA结合位点SNPs分析可以帮助我们确定HCC患者亚组中的发病风险和治疗预后。为此，本实验将筛选HCC患者位于靶基因3′UTR的4个miRNA结合位点SNPs，包括兰尼碱受体3(RYR3)(rs1044129)，C14orf101(rs4901706)，KIAA0423(rs1053667)和GOLGA7(rs11337)，了解它们与 HCC患病风险和预后的关系，评估其在HCC患者发生发展中的作用。本研究分为三个部分：
　　第一部分：肝细胞癌患者 microRNA结合位点单核苷酸多态性的筛选与鉴定。
　　目的：本实验拟结合文献，并通过NCBI dbSNP数据库公布的3'UTR miRNA结合位点SNPs，筛选出可能影响HCC患者发病及预后的基因位点，为HCC的精准治疗奠定良好的基础。
　　方法：⑴收集从2008年1月到2010年12月河北医科大学第二医院肝胆外科连续95例接受HCC切除术并经病理证实的HCC患者的血液样本。对照组：选择同期在我院体检中心查体的90例无癌症病史的健康对照血液标本。所有实验均获得所有患者同意并经医院伦理委员会监督批准。⑵收集上述 HCC患者的临床资料。临床数据包括性别、年龄、Child-Pugh分级、门静脉瘤栓是否形成、肿瘤数量、肿瘤直径和TNM分期等。对HCC术后患者通过电话对其随访，如病重或死亡则对其家属进行随访，以了解患者生存情况，随访时间为3年。⑶统计上述临床资料HCC患者术后3年存活率之间的差异，并统计出可能影响生存率的相关因素。应用DNA纯化试剂盒对HCC患者全血基因组DNA进行提取并提纯。根据NCBI数据库查找到的上述4个miRNA结合位点SNPs相应的核苷酸序列，设计出PCR扩增所需上下游引物，并按照PCR Master Mix Kit流程扩增上述基因，采用Snapshot方法鉴定各SNPs基因型。⑷统计学方法：对HCC组和正常对照组的性别、年龄等计量资料进行比较均采用t检验(student t-test)，分析HCC和对照组SNP分布频率采用χ2检验(Pearson Chi-Square test)进行分析，估计组间生存率和绘制累计生存函数曲线采用Kaplan-Meier方法，检验各组生存曲线分布的异同，比较生存率有无差别应用Log-rank方法，多因素生存分析采用Cox比例风险模型进行。不同组间比较均采用 t检验分析数据。所有统计数据均应用 SPSS18.0统计软件进行数据分析，P<0.05表示差异有显著性。
　　结果：①研究对象：对HCC组与对照组的年龄、性别进行比较，结果显示两组年龄(58.74±12.58 vs56.83±9.80, P=0.853)、性别(84/11 vs81/9, P=0.730)均衡可比，差异无统计学意义。各临床特征的术后3年生存率如下：男性vs女性(31.6% vs22.2%, P=0.530)，年龄≤60岁vs＞60岁(28.8% vs34.5%, P=0.742)，Child-Pugh分级A级vs B级(32.9% vs0%, P=0.019)，门静脉瘤栓形成vs无瘤栓形成(32.5%vs12.5%, P=0.027)，肿瘤直径(单位厘米)≤5 vs＞5(35.7%vs28.3%, P=0.765)，TNM分期0~ⅠvsⅡ~Ⅲ(46.7% vs22.4%, P=0.017)，单发肿瘤 vs多发肿瘤(30.9% vs30.0%, P=0.871)。②miRNA结合位点SNP分布频率分析：对HCC组和正常对照组的4个miRNA结合位点SNPs分布频率分析显示，所有4个SNPs，rs1044129、rs4901706、rs1053667、rs11337，分布频率均无显著性差异，说明实验所筛选各SNP位点可能都与HCC发病无明显相关。3)生存分析：分析HCC患者术后3年生存率结果显示，RYR3基因结合位点 rs1044129， AA基因型 vs AG+GG(39.4％ vs25.5％, P=0.047)；C14orf101基因结合位点 rs4901706，GG基因型 vs AA+AG(27.1％ vs35.0％, P=0.573)；KIAA0423基因结合位点 rs1053667，TT基因型 vs CT+CC(32.8％ vs26.7％, P=0.717)；GOLGA7基因结合位点rs11337，GG基因型 vs GT+TT(30.8％ vs30.6％, P=0.594)。我们应用Cox比例风险模型对这些预测因素进行了多变量分析，结果显示， RYR3相对危险度为1.812(95%可信区间：1.026~3.201, P=0.041)，Child-Pugh分级相对危险度为2.464(95%可信区间：1.020~5.951, P=0.045)，TNM分期相对危险度为1.922(95%可信区间：1.037~3.562, P=0.038)，门静脉瘤栓形成相对危险度为1.571(95%可信区间：0.664~3.719, P=0.304)。
　　第二部分：RYR3基因microRNA结合位点单核苷酸多态性与术后HCC患者预后的关系。
　　目的：本部分研究，我们将对位于3′UTR RYR3基因miRNA结合位点 rs1044129各基因型在 HCC患者组织中的表达进行分析，并且通过HeLa细胞转染目的基因了解其对癌细胞活性的影响，以此评估rs1044129与HCC预后的关系。
　　方法：⑴对象来源：病例组选择88例接受原发性肝癌切除术并经病理证实的HCC患者。对照组选择45例同时期因肝脏海绵状血管瘤、肝内胆管结石以及其它肝脏良性疾病进行手术治疗的患者，留取各试验组肝脏组织。⑵HCC患者全血基因组DNA提取，目的基因PCR扩增及基因型分析，同第一部分。⑶免疫组织化学方法检测 RYR3在肝脏组织的定位表达，应用组织化学评分方法对实验结果判定。⑷根据 RYR3的核苷酸序列设计出含有AA或GG基因型的2条寡核苷酸链的正义，反义引物链，构建质粒并转染 HeLa细胞，应用psiCHECKTM-2载体检测转染 RYR3基因对 HeLa细胞系细胞活性的影响。⑸统计学方法：分析 RYR3组各基因型在 HCC组织表达情况采用χ2检验，采用 Kaplan-Meier检验比较RYR3低表达与高表达HCC患者的术后生存率，采用t检验比较组间不同的荧光素酶基因表达水平。所有数据分析均使用SPSS18.0统计软件包处理，P<0.05表示差异有显著性。
　　结果：①应用免疫组织化学方法检测了收集的88例 HCC组织RYR3表达情况并计算相应的组织化学评分。HCC患者RYR3(rs1044129) AA型低表达vs高表达(29例 vs4例)，AG型低表达vs高表达(8例 vs33例)，GG型低表达vs高表达(3例 vs11例)。χ2检验显示，RYR3 AA基因型的HCC患者，比AG和GG型患者表达水平更低，与二者比较均有显著性差异(P=0.001)。②HCC肝组织RYR3(rs1044129)低表达患者人数vs高表达(40例vs48例)，术后3年生存率低表达患者vs高表达(54.91 vs27.45, P=0.032)。③应用含有 AA或 GG基因型寡核苷酸链的质粒转染HeLa细胞后，我们观察到海肾荧光素酶活性与萤火虫荧光素酶活性比AA基因型vs GG(1.61±0.09 vs2.01±0.14, P=0.019)。
　　第三部分：RYR3基因microRNA结合位点单核苷酸多态性对人肝癌细胞系SMMC-7721细胞功能的影响。
　　目的：应用人肝癌细胞系SMMC-7721作为研究对象，采用小干扰RNA技术沉默RYR3在肝细胞癌SMMC-7721细胞中的表达，观察转染RYR3 siRNA后肝细胞癌SMMC-7721细胞增殖与凋亡的变化，了解位于RYR3基因miRNA结合位点rs1044129对肝癌细胞功能的影响，以此证实其对HCC患者预后的影响。
　　方法：⑴以psi-U6为载体构建RYR3敲低质粒，合成4对候选RYR3-shRNA和1对阴性对照 NC-shRNA。制备感受态大肠埃希菌，并进行质粒转化及提取，应用质粒和 Lipofectamine2000混合液转染人肝癌细胞系SMMC-7721细胞，经过培养后倒置显微镜下观察到培养的肝癌细胞出现绿色荧光，证明细胞转染成功。将实验细胞分为3组，正常对照组(Blank-control)，阴性对照转染组(Control-siRNA/Lipofactamine2000)和实验组(RYR3-siRNA/Lipofactamine2000)。⑵Western blot方法筛选出RYR3沉默最佳的人肝癌细胞系SMMC-7721细胞进行后续的实验。⑶MTS法检测转染RYR3基因后对人肝癌细胞系SMMC-7721细胞增殖的影响。⑷应用流式细胞仪检测转染RYR3基因后对人肝癌细胞系SMMC-7721细胞凋亡的影响。⑸统计学方法：评估Blank-control和Control-siRNA与RYR3转染组的差异采用两独立样本t检验，所有数据分析均使用SPSS18.0统计软件包处理，P<0.05被认为有统计学意义。
　　结果：①质粒转染人肝癌细胞系SMMC-7721细胞后，培养48 h后通过倒置荧光显微镜在激发波长480 nm条件下检测转染细胞，镜下可见肝癌细胞表达GFP绿色荧光，转染效率达到91%。②应用Western blot检测 SMMC-7721细胞结果显示：转染48 h后，siRNA-1， siRNA-2, siRNA-3和siRNA-4均有效降低SMMC-7721细胞内源RYR3蛋白的表达水平，与对照组相比分别降低了48.6%、54.7%、36.9%和38.2%。因此，选取沉默最佳的siRNA-2用于后续的细胞功能实验。③应用MTS法检测人肝癌细胞系SMMC-7721细胞转染RYR3-siRNA基因后0 h，12 h，24 h，36 h，48 h，60 h，72 h的吸光值(OD)。研究结果显示，RYR3-siRNA组的OD值分别为0.867±0.010、1.184±0.059、1.441±0.082、1.659±0.102、1.744±0.065、1.862±0.033、1.998±0.093；Control-siRNA组分别为0.868±0.080、1.327±0.052、1.837±0.076、2.220±0.138、2.449±0.072、2.535±0.035、2.613±0.176；Blank-control组0.863±0.107、1.568±0.131、1.919±0.059、2.554±0.082、2.715±0.078、2.804±0.112、2.986±0.086。在各观察时段SMMC-7721细胞生长均出现不同程度的抑制，且抑制率随转染后培养时间的延长而增加，各时间段比较有显著性差异，且与Control-siRNA组和 Blank-control组也有显著性差异(P<0.05)。④转染RYR3对人肝癌细胞系SMMC-7721细胞凋亡的影响：通过流式细胞仪检测转染后肝癌细胞凋亡率可见，转染后肝癌细胞 RYR3-siRNA组凋亡率为39.010±1.677，Control-siRNA组为12.379±1.075，Blank-control组为5.373±0.456，RYR3-siRNA组凋亡率与其余2组凋亡率相比明显下降，结果均有显著性差异(P<0.05)。
　　结论：⑴筛选与HCC术后三年生存率相关的临床特征和4个miRNA结合位点SNPs发现，Child-Pugh分级、TNM分期、RYR3(rs1044129)与HCC术后3年生存率明显相关。⑵HCC患者rs1044129 AA型肝组织中RYR3表达较其它类型减少最为明显，RYR3低表达患者生存时间比高表达患者明显延长，RYR3转染HeLa细胞后其细胞活性AA型比GG型降低更为明显。⑶RYR3(rs1044129)沉默可抑制SMMC-7721肝癌细胞增殖并诱导其细胞凋亡。总之，本课题研究表明，位于3'UTR的RYR3 miRNA结合位点rs1044129 SNP通过影响miRNA与RYR3的结合力而影响RYR3表达，继而RYR3通过对肝癌细胞增殖、凋亡的影响来调控HCC预后，RYR3可以作为一个独立的生物标记物来预测HCC的预后。

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引言

第一部分肝细胞癌患者microRNA结合位点单核苷酸多态性的筛选与鉴定

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分RYR3基因microRNA结合位点单核苷酸多态性与术后HCC患者预后的关系

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分RYR3基因miRNA结合位点单核苷酸多态性对人肝癌细胞系SMMC-7721细胞功能的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一:microRNA及其结合位点单核苷酸多态性与肝细胞癌的相关性研究

综述二:炎性肠病关节炎发病机制新进展

致谢

个人简历