LncRNA H19/miR-675-5p通过靶向Mfn2调控血管平滑肌细胞增殖和凋亡

摘要

目的：血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）是构成血管壁组织结构及维持血管张力的主要细胞成分，VSMC异常增殖和凋亡是动脉粥样硬化等血管重塑性疾病的病理学基础。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸、没有蛋白质编码功能的RNA，广泛参与了VSMC的功能调控。我们通过转录组测序分析发现，大量lncRNA在大鼠内膜增生血管中表达出现异常，其中lncRNA H19表达水平异常升高，H19是否参与了血管内膜增生的调控？其分子机制如何？目前还不清楚。本研究拟从分子、细胞和整体水平，探究H19在VSMC增殖、凋亡和血管内膜增生中的功能及分子机制。
　　方法：
　　1.对大鼠行颈总动脉球囊内皮剥脱术，构建血管内皮损伤模型，28天后将内膜增生血管与正常血管取材，进行转录组测序分析。对差异mRNA进行GO和Pathway分析，并通过qRT-PCR验证。
　　2.体外培养 VSMC并分别转染 siRNA Control、siRNA H19、miR-675-5p inhibitor、siRNA H19＋miR-675-5p mimic、miR-675-5p mimic。使用CCK8检测试剂盒对细胞活性进行检测，使用AnnexinV-FITC/PI染色检测试剂盒配合流式细胞术对细胞凋亡和细胞周期进行检测，使用Western Blot方法对相关基因的蛋白表达量进行检测。
　　3.构建pGL3-Mfn2-3'UTR（包括野生型和突变型）报告基因重组载体，并进行荧光素酶活性检测，用以确认miR-675-5p与Mfn2的结合位点。
　　4.采用H19的siRNA干预大鼠颈总动脉内皮损伤模型，于21天后取血管样本，通过冰冻切片HE染色分析血管内膜／中膜比值，对内膜增生情况进行分析。
　　结果：
　　1.大鼠内膜增生血管转录组测序分析
　　测序结果显示，与正常血管相比，内膜增生血管中有235个mRNA表达上调，170个mRNA表达下调；329个lncRNA表达上调，473个lncRNA表达下调。(Log2 fold change≥1.0或≤-1，P<0.05)。与正常血管相比，VSMC分化标志基因钙调蛋白（calponin，Cnn1）、平滑肌肌动蛋白α2（smooth muscleα-actin，Acta2）、平滑肌22α（smooth muscle22 alpha，SM22α）、平滑肌肌球蛋白重链（smooth muscle myosin heavy chain11，Myh11）、平滑肌细胞分化特异性蛋白（recombinant smoothelin, Smtn）等表达水平均明显下降，表明大鼠血管内膜损伤增生模型构建成功。
　　对差异mRNA进行GO和Pathway分析发现，与血管内膜损伤增生相关的生物学进程主要表现在骨骼肌收缩和肌丝滑动等方面，而关联性较大的通路也主要存在于心肌肥厚、心肌收缩、紧密连接等方面。以上参与的生物过程均与VSMC对血管生理功能的调节密切相关，可从多种途径涉及VSMC的增殖与分化。
　　2.H19/miR-675-5p通过靶向Mfn2促进VSMC增殖，并抑制其凋亡
　　进一步比对探究，并通过qRT-PCR验证显示，与正常血管相比，内膜损伤后H19表达水平显著升高。并且miR-675-5p作为H19基因第一外显子区编码生成的microRNA，其表达水平也显著升高。初步证明H19/miR-675-5p可能在调控VSMC增殖和凋亡中发挥重要作用。
　　将体外培养的5组分别转染siRNA Control、siRNA H19、miR-675-5p inhibitor、siRNA H19＋miR-675-5p mimic、miR-675-5p mimic的VSMC进行多项检测。结果显示，与对照组相比，siRNA H19组和miR-675-5p inhibitor组细胞活性明显降低，凋亡细胞比值升高而处于G2/M期的细胞比值降低，凋亡相关标志蛋白表达量上升而增殖相关标志蛋白表达量下降。miR-675-5p mimic组细胞检测结果与siRNA H19组和miR-675-5p inhibitor组完全相反。共转染siRNA H19和miR-675-5p mimic组的细胞检测结果则显示加入miR-675-5p mimic可有效逆转siRNA H19对细胞的影响（P<0.05）。证实H19/miR-675-5p参与VSMC细胞活性的调控，可促进VSMC增殖，并抑制其凋亡。
　　通过生物信息学预测分析，Mfn2的3'UTR存在一个miR-675-5p结合位点，推测Mfn2可能是H19通过miR-675-5p发挥调控作用的下游靶点。荧光素酶报告基因分析结果表明，miR-675-5p与Mfn2的3'UTR存在直接相互作用。且Western Blot检测发现，抑制miR-675-5p的表达后，与对照组相比Mfn2表达量有所上升（P<0.05），证实Mfn2可作为是miR-675-5p的调控靶标。
　　3.敲降H19抑制大鼠血管内膜增生
　　冰冻切片HE染色结果显示，球囊损伤后，内膜呈弥漫性进行性增厚，管腔变小，而敲降H19组内膜增厚程度明显小于对照组（P<0.05）。Western Blot分析进一步表明，敲降 H19抑制了增殖表型标志基因PCNA的表达，促进了收缩表型标志基因SM22α的表达。
　　结论：
　　1.血管内膜增生过程中，大量lncRNA表达水平发生改变；
　　2.Mfn2是miR-675-5p的调控靶标；
　　3.lncRNA H19通过miR-675-5p/Mfn2调控轴，抑制VSMC凋亡，促进VSMC增殖和血管内膜增生。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

1大鼠内膜增生血管转录组测序分析

2 H19促进VSMC增殖，抑制VSMC凋亡

3 H19/miR-675-5p促进VSMC增殖，抑制VSMC凋亡。

4 Mfn2是miR-675-5p的调控靶标

5敲降H19抑制大鼠血管内膜增生

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:lncRNA H19的研究进展

致谢

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