间充质干细胞联合白藜芦醇治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的作用与机制研究

摘要

多发性硬化是以中枢神经系统炎性脱髓鞘为特点的自身免疫性疾病，目前尚无安全有效的治疗方法。实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠是研究多发性硬化常用的动物模型。白藜芦醇是一种天然多酚类化合物，具有抗炎抗氧化特性，研究显示其对多种自身免疫性疾病有治疗作用。间充质干细胞具有多向分化潜能、免疫调控和自我复制等特点，对多发性硬化有潜在的治疗作用。我们通过探讨间充质干细胞联合白藜芦醇治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的作用和机制，为治疗多发性硬化提供新的思路。本研究分三部分，现将各部分内容概述如下。
　　第一部分：白藜芦醇对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠血脑屏障完整性的影响
　　目的：研究白藜芦醇对于实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠的疾病进程缓解的机制，探究白藜芦醇对EAE小鼠的血脑屏障完整性的影响。
　　方法：使用8-10周龄的C57BL/6雌鼠实验，将抗原MOG35-55用生理盐水稀释成5mg/ml，并按1:1等体积加入完全弗氏佐剂（其中结核杆菌H37Ra终浓度为4mg/ml）混合，乳化后按每只0.1ml于小鼠脊柱两侧分四点皮下注射，第0h及第48h腹腔注射500ng0.5ml百日咳毒素（PTX），建立EAE小鼠模型。免疫在乙醚麻醉和充分固定下进行。采用Knoz5分评分法对实验小鼠临床评分。通过50天观察小鼠的临床评分，来判断EAE小鼠使用或者不使用不同剂量白藜芦醇处理前后临床评分情况。在免疫后21天通过小鼠尾静脉注射伊文思蓝染液后将小鼠脑组织速冻，切片拍照观察脑部的完整性；通过免疫印迹技术检测白藜芦醇处理后跨膜紧密连接蛋白ZO-1，occludin和claudin-5的表达情况。并同时检测细胞间粘连分子ICAM-1和血管粘附蛋白VCAM-1的表达变化。利用实时定量PCR检测促炎基因iNOS和IL-1、抗炎基因arginase1及NADPH氧化酶的表达；ELISA法检测血清细胞因子IL-10水平。利用lucigenin实验检测NADPH氧化酶的活性，从而观察白藜芦醇对氧化压力的缓解作用。
　　结果：
　　1、白藜芦醇治疗能够降低EAE小鼠的疾病严重性。在50天的观察期内，使用10 mg/kg的白藜芦醇并不能抑制疾病的发生进程，高剂量25mg/kg和50 mg/kg均能显著的降低EAE的疾病严重性，使用25mg/kg和50 mg/kg的白藜芦醇相对于PBS组的平均和最大临床评分都显著降低。
　　2、使用25mg/kg或是50mg/kg白藜芦醇处理EAE小鼠与对照组相比，可以显著的防止伊文思蓝染液进入脑部的量。而10mg/kg的白藜芦醇效果与对照组没有显著差异。
　　3、白藜芦醇处理可以显著改善EAE诱导的紧密连接蛋白的丢失。通过免疫印迹技术检测发现ZO-1、occludin和claudin-5的表达在EAE小鼠中显著降低，而使用25mg/kg或是50mg/kg白藜芦醇可以显著抑制ZO-1, occludin和claudin-5蛋白的丢失。
　　4、白藜芦醇能够抑制EAE小鼠脑组织中ICAM-1和VCAM-1蛋白的上调。免疫印迹结果显示在EAE小鼠脑组织中ICAM-1和VCAM-1蛋白表达显著升高。而使用25mg/kg或是50mg/kg白藜芦醇处理可以降低ICAM-1和VCAM-1蛋白的表达。
　　5、在EAE小鼠中促炎基因iNOS和IL-1显著的升高，25mg/kg或是50mg/kg白藜芦醇可以显著抑制两者的水平，而同样在EAE小鼠中，局部的抗炎基因arginase1和细胞因子IL-10的表达轻微的上调，使用25mg/kg或是50mg/kg白藜芦醇后可以显著上调两者的表达，而10mg/kg白藜芦醇并不影响这两种分子的表达。
　　6、白藜芦醇可以显著抑制EAE小鼠NADPH氧化酶(NOX)的表达量和活性。EAE小鼠表达有升高的NOX1、NOX2和NOX4。白藜芦醇的处理并不影响NOX1的表达，但是可以显著抑制NOX2和NOX4的上调，用25mg/kg或是50mg/kg白藜芦醇同样也可以抑制EAE小鼠中NADPH氧化酶的活性。
　　第二部分：白藜芦醇对间充质干细胞在氧化应激和炎症环境的保护作用
　　目的：小鼠来源的间充质干细胞已经被证明对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠有一定的神经保护作用，但是由于脑脊髓炎小鼠体内的氧化应激环境和炎症环境容易影响间充质干细胞的生物活性，进而影响干细胞的治疗效果。我们通过体外实验探讨白黎芦醇对间充质干细胞在这两种环境下的保护作用。
　　方法：从6-8周龄的C57BL/6的腿骨中取出骨髓细胞，进行传代培养，取第4代培养细胞用于实验研究。使用抗Sca-1，CD14，CD34，CD44和CD45的抗体标记，通过流式细胞术鉴定从小鼠体内提取的间充质干细胞。骨髓间充质干细胞（mBM-MSCs）分别经过20ng/ml的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）或500mM的过氧化氢（H2O2）的处理，TNF在培养环境中持续存在；过氧化氢处理4小时。在体外培养的第1，3和5天MTT法测定细胞增殖和上清液乳酸脱氢酶（LDH）测定细胞损伤；应用不同浓度的白藜芦醇（0.1、1、10μmol/L）预处理mBM-MSCs，重复上述培养过程。
　　结果：
　　1、采用贴壁持续培养的小鼠骨髓细胞经流式抗体标记，鉴定后确实带有间充质干细胞的表面标记蛋白。
　　使用抗Sca-1，CD14，CD34，CD44和CD45的抗体标记，通过流式细胞术鉴定出从小鼠体内提取出的骨髓细胞经体外培养6周后，分离出带有间充质干细胞表型的一群细胞亚群，而这群细胞主要是小鼠来源的间充质干细胞。
　　2、白藜芦醇能够降低H2O2和TNF-α诱导的细胞毒性。通过MTT检测细胞活性并检测上清液LDH的泄漏表明，H2O2（500 mM）或是TNF-α（20 ng/mL）能够显著降低细胞生存并升高LDH的泄漏。而白藜芦醇能够降低这种细胞毒性。
　　第三部分：间充质干细胞联合白藜芦醇对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠炎症的影响
　　目的：研究间充质干细胞联合白藜芦醇治疗缓解EAE小鼠疾病进程的机制，探究联合治疗对EAE小鼠炎症的作用。
　　方法：通过观察小鼠的临床评分，来判断EAE小鼠使用间充质干细胞联合白藜芦醇处理的效果。通过H&E染色和抗CD4的免疫组化检测单核细胞和T淋巴细胞对于脊髓组织的浸润。利用ELISA检测白藜芦醇和间充质干细胞处理后EAE小鼠血清中Th1型细胞因子IFN-γ/TNF-α和Th2型细胞因子IL-4/IL-10的表达量。
　　结果：
　　1、间充质干细胞联合白藜芦醇治疗能够显著降低EAE小鼠的疾病严重程度。使用白藜芦醇联合间充质干细胞可以显著的延缓EAE疾病进程。间充质干细胞或是白藜芦醇治疗后能够显著降低平均的临床评分（PBS处理组中平均临床评分为2.63±0.42；mBM-MSCs处理组1.34±0.31；白藜芦醇处理组1.44±0.38；PBS组与mBM-MSCs相比P<0.01；PBS组与白藜芦醇处理组相比P<0.01）和最大临床评分（PBS组3.76±0.32；mBM-MSCs处理组1.83±0.27；白藜芦醇处理组1.74±0.31；PBS组与mBM-MSCs组相比P<0.01；PBS与白藜芦醇组相比P<0.01）。而两者联用比单独使用效果更好（联用的平均临床评分0.64±0.27；mBM-MSCs组与联用相比P<0.01；白藜芦醇组与联用相比P<0.01；联用最大临床评分0.91±0.22；mBM-MSCs组与联用组相比P<0.01；白藜芦醇处理组与联用组相比P<0.01）。
　　2、间充质干细胞和白藜芦醇联合使用可以降低EAE小鼠脊髓中的炎症细胞数目。使用H&E染色和抗CD4的免疫组化检测发现EAE小鼠脊髓中的炎性单核细胞和T细胞的浸润显著升高，而单独使用间充质干细胞或是白藜芦醇与PBS组对比可以显著降低浸润细胞的数目（PBS组与mBM-MSCs处理组相比P<0.05；PBS组与白藜芦醇处理组相比P<0.01），而间充质干细胞联合白藜芦醇可以更加显著的降低炎性细胞的浸润（mBM-MSCs处理组与联合治疗组相比P<0.01；白藜芦醇处理组与联合治疗组相比P<0.01）。
　　3、间充质干细胞联合白藜芦醇能够促进EAE小鼠中Th1型向Th2型细胞因子的转变。在单独使用间充质干细胞或是白藜芦醇处理的EAE小鼠中Th1型细胞因子IFN-γ/TNF-α显著的降低，而Th2型细胞因子IL-4/IL-10的表达量显著升高（IFN-γ:PBS处理组与mBM-MSCs处理组P<0.01；PBS处理组与白藜芦醇处理组相比P<0.01；TNF-α:PBS处理组与mBM-MSCs处理组相比P<0.01；PBS处理组与白藜芦醇处理组相比P<0.01；IL-4:PBS处理组与mBM-MSCs处理组相比P<0.01；PBS处理组与白藜芦醇处理组相比P<0.01；IL-10:PBS处理组与mBM-MSCs处理组相比P<0.01；PBS处理组与白藜芦醇处理组相比P<0.01）。而间充质干细胞联合白藜芦醇治疗后这种细胞因子转换效果更加显著。（IFN-γ:mBM-MSCs处理组与联合治疗组相比P<0.01；白藜芦醇处理组与联合治疗组相比P<0.05；TNF-α:mBM-MSCs处理组与联合治疗组相比P<0.05；白藜芦醇处理组与联合治疗组相比P<0.05；IL-4:mBM-MSCs处理组与联合治疗组相比P<0.05；白藜芦醇处理组与联合治疗组相比P<0.05；IL-10:mBM-MSCs处理组与联合治疗组相比P<0.01；白藜芦醇处理组与联合治疗组相比P<0.01）。
　　结论：
　　1、白藜芦醇可以显著保护EAE小鼠的血脑屏障完整性。白藜芦醇单独使用可以有效降低EAE疾病的严重性，可以显著的防止伊文思蓝染液进入脑部的量。可能是通过抑制紧密连接蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的丢失，抑制EAE小鼠脑组织中上调的粘附因子ICAM-1和VCAM-1蛋白，抑制EAE小鼠促炎基因iNOS和IL-1的表达，上调抗炎基因arginase1和细胞因子IL-10的表达，抑制EAE小鼠NADPH氧化酶的表达量和活性来实现。
　　2、 H2O2或是TNF-α模拟的氧化应激和炎症环境能够显著降低间充质干细胞生存并升高LDH的泄漏。白藜芦醇能够降低H2O2和TNF-α诱导的对间充质干细胞的细胞毒性作用。
　　3、间充质干细胞联合白藜芦醇治疗可以显著的延缓EAE疾病进程，同时联合治疗能够显著降低小鼠EAE模型的疾病严重性，从而改善EAE疾病的临床评分。可以降低EAE小鼠脊髓中的炎症细胞数目，并且间充质干细胞和白藜芦醇能够促进EAE小鼠中Th1型向Th2型细胞因子的转变。

目录

声明

英文缩写

引言

第一部分白藜芦醇对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠血脑屏障完整性的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分白藜芦醇对间充质干细胞在氧化应激和炎症环境的保护作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分间充质干细胞联合白藜芦醇对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠炎症的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一:间充质干细胞与多发性硬化

综述二:白藜芦醇的抗炎效果及在免疫相关疾病治疗中的应用

致谢

个人简历

一、一般情况

二、个人经历

三、发表论文

四、承担和主研课题情况