欧文氏菌类胡萝卜素合成相关基因遗传转化水稻的初步研究

摘要

水稻(Oryza sativa L)是世界上最重要的粮食作物之一，水稻的稳定高产是我国粮食安全的重要保障。然而，水稻生长期间经常遭受自然界多种多样的逆境胁迫伤害，由此而造成的活性氧增多会引发细胞氧化伤害，最终导致水稻大量减产，并严重影响水稻的品质。提高水稻产量，改善水稻品质是水稻育种方面重要的研究内容，人们通过植物基因工程将抗氧化的基因导入水稻基因组，期望获得高产稳产的优良品种。 类胡萝卜素(carotenoid)是植物和微生物光合膜的组成部分，可保护光合系统免受强光氧化破坏。许多类胡萝卜素是维生素A的重要来源，又是强抗氧化剂。欧文氏菌(Erwinia uredovora)作为一种微生物，拥有比植物简单而且节能的类胡萝卜索合成途径。而其中crtB，crtI，crtY是β-胡萝卜素合成过程中几个关键的酶。 本实验首先通过基因工程技术以pACCAR16△crtX质粒为模板，PCR克隆得到欧文氏菌中类胡萝卜素合成途径中三个关键基因crtB，crtI，crtY；再用绿色组织特异性启动子Cab及其导肽分别与crtB，crtI，crtY连接构建表达盒CBN(Cab-crtB-NOS)，CIN(Cab-crtI-NOS)以及CYN(Cab-crtY-NOS)，驱动三者的表达。将表达盒导入双元转化载体pC1301中构建三个绿色组织特异性转基因载体；然后一方面通过农杆菌介导的遗传转化法将pC1301-Cab-crtB-NOS、pC1301-Cab-crtI-NOS和pC1301-Cab-crtY-NOS分别单独转化水稻品种粳稻中花11及籼稻9311，最终获得含crtB、crtI、crtY基因的转基因水稻各40株；另一方面通过基因枪介导的遗传转化法将三个重组质粒共转化水稻品种粳稻中花11，获得转基因植株20株。之后对转基因愈伤组织、根及种子的GUS报告基因活性进行鉴定，鉴定阳性率达80％，初步证明转基因成功；成苗后对转基因T0代植株叶片提取DNA，进行PCR鉴定进一步证明crtB、crtI、crtY基因转化水稻获得成功。 除此之外，克隆crtB，crtI，crtY基因插入原核表达载体pet32a，在大肠杆菌BL21经IPTG诱导进行表达，实验表明蛋白主要以包涵体形式表达：经SDS-PAGE分离获得抗原并免疫新西兰白兔制备了crtB，crtI，crtY抗体；经Western blot检测，抗体血清以梯度稀释至107倍时依然可以与抗原杂交获得清晰、明显的条带，证明获得的抗体血清，特异性好，效价高达到1:10000000，为进一步鉴定转基因水稻中crtB，crtI，crtY蛋白的表达做好准备。 本研究通过转基因技术过量表达crtB，crtI，crtY因初步获得稳定的转基因水稻株系，还需要进一步进行转基因植株的抗氧化实验，验证其抗氧化能力，为最终阐明类胡萝卜素在水稻绿色组织中抗氧化机理、创造出抗氧化胁迫水稻新种质提供了一定的证据。

目录

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引言

1文献综述

1.1类胡萝卜素简介

1.1.1类胡萝卜素的结构

1.1.2类胡萝卜素生物合成途径中关键基因及其基因工程

1.1.3类胡萝卜素的功能

1.1.5 β-胡萝卜素的功能

1.1.6类胡萝卜素的生物合成途径

1.2活性氧与类胡萝卜素

1.2.1逆境胁迫与ROS

1.2.2 ROS的产生

1.2.3 ROS产生的伤害

1.2.4 ROS与类胡萝卜素关系

1.3高等植物启动子的研究进展

1.3.1组成型启动子

1.3.2组织特异型启动子

1.3.3诱导型启动子

1.3.4 Cab启动子

1.4水稻遗传转化方法研究进展

1.4.1直接转化法

1.4.2间接转化法

2材料与方法

2.1实验材料与设备

2.1.1植物、动物材料

2.1.2菌株

2.1.3载体

2.1.4试剂

2.1.5主要仪器设备

2.1.6试验中所使用引物序列及其酶切位点

2.1.7常用试剂配方及培养基配方

2.2方法

2.2.1水稻绿色组织特异性表达载体的构建

2.2.2表达盒的构建

2.2.3转基因工程载体电击转化杆菌EHA105

2.2.4农杆菌介导遗传转化法水稻愈伤组织

2.2.5基因枪法转化

2.2.6转基因植株验证分析

2.2.7原核表达载体构建

2.2.8抗体制备

2.2.9 Western blot分析

3结果和分析

3.1转基因工程载体的构建和检测

3.1.1载体构建策略示意图

3.1.2初级载体pUC18-crtB/I/Y/Cab/NOS构建

3.1.3中间载体pUC18-NOS-crtB/I/Y/构建

3.1.4中间载体pUC18-NOS-crtB/I/Y-Cab的构建

3.1.5表达盒的构建

3.1.6转基因载体pC1301-CBN/CIN/CYN构建

3.2转基因植株的获得

3.3转基因植株PCR验证

3.3.1报告基因GUSPCR验证

3.3.2筛选基因HynPCR验证

3.4 GUS染色鉴定阳性植株

3.5 pet32a-crtB，pet32a-crtl，pet32a-crtY原核表达载体构建

3.6目的蛋白的原核表达

3.7 Western blot验证抗体质量

4讨论

4.1使用特异性启动子提高转录水平

4.2农杆菌介导籼稻品种高效转化平台的利用

4.3外源基因共转化

4.4外源基因转化水稻的影响

4.5抗体制备

5结论

参考文献

附录

后记(含致谢)

攻读学位期间取得的科研成果清单