黄瓜灰霉病高效拮抗菌的筛选鉴定及其作用研究

摘要

由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)侵染引起的灰霉病可危害多种果蔬,造成严重的经济损失。长期使用化学农药,对生态环境和人类健康造成了极大危害,生物防治是一种环境友好、安全有效的防治技术。为获得性状优良的生防菌直接服务于生产,本论文从防治灰霉病的高效广谱生防细菌的菌种分离鉴定、发酵条件、抗菌物质分离、防病促生效果等方面进行了比较系统的研究。
　　用稀释平板分离法从河北、山东、长春、南昌、兰州等地的土壤样品中分离到264株芽孢杆菌。以黄瓜灰霉病菌为指示菌,采用对峙培养法筛选到4株产抑菌活性代谢产物的高效拮抗菌。通过传代稳定性和抗菌谱测定,筛选到一株遗传性能稳定,抗菌谱广的生防菌株ch2-22。结合形态特征观察、生理生化特性分析以及16S rDNA序列分析,将拮抗菌ch2-22鉴定为短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)。
　　以NB培养基为发酵培养基,采用单因子试验,对ch2-22最佳发酵条件研究表明,种子液培养时间为14h,发酵时间60h,发酵温度30℃,初始pH值7.0～7.5,装液量50mL/250mL,接种量4％。菌株ch2-22抗菌物质性质研究表明,抗菌物质对热和酸碱稳定性强,经强光和紫外线照射性质稳定,对氯仿、蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶不敏感,反复冻融和长期保存对抗菌物质活性无影响,紫外检测在196nm处有紫外吸收峰。
　　用有机溶剂对菌株ch2-22的发酵滤液进行萃取,有机相均无抑菌活性,推测抗菌物质为水溶性物质。利用浓盐酸和低温乙醇沉淀法来分离抗菌物质,得到具有抑菌活性的上清液,将上清液用3kD中空纤维素膜进行超滤,截留液和滤出液均有抑菌活性,显示有多种抗菌物质存在。利用Tricine-SDS-PAGE测定截留液和滤出液中抗菌物质分子量,截留液中存在分子量大约为15kD、11kD、7.5kD和3kD的物质,而滤出液中仅有一种物质,分子量为3kD左右。
　　抑菌机理研究表明,ch2-22分泌的抗菌物质能够强烈抑制灰霉病菌菌丝生长和孢子萌发。该菌株能分泌蛋白酶,可以降解真菌细胞壁蛋白成分,使病原菌菌丝受到破坏,从而抑制病原菌生长。用ch2-22发酵滤液诱导处理黄瓜幼苗,可显著提高植物体各种防御酶:过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和植物体病程相关蛋白:β-1,3葡聚糖酶、几丁质酶的酶活性,从而提高植物体抗病能力。
　　菌株ch2-22离体防效实验表明,发酵滤液100倍稀释液对黄瓜狄霉病的防治效果可达100％。室内盆栽试验表明,100倍稀释液防效最好,预防效果为87％,治疗效果为76％,防病效果优于治疗效果。菌株ch2-22发酵滤液50倍和100倍稀释液能够促进种子的萌发和根芽的生长,在株高、茎粗、展开叶片数、叶片面积、鲜重、干重等方面均有明显的促进作用,并且植株叶片中的叶绿素、可溶性蛋白、可溶性糖的含量也有显著提高。这为黄瓜的生长提供了良好的生理基础,进而提高黄瓜产量和改善黄瓜品质。