AαC诱导HepG2和A549细胞基因毒性及氧化应激作用研究

摘要

杂环胺是在煎炸、烧烤食品、烟气及汽车尾气中广泛存在的一类有害物质。2–氨基–9–氢–吡啶并[2,3–b]吲哚（AαC），主要存在于卷烟烟气中，其在主流烟气中的释放量约为60-258ng/支，由于 AαC是可疑的人体致癌成分（2B类致癌物），并且，吸烟会引起吸烟者AαC暴露量的显著增加。因此，研究AαC的基因毒性作用对烟气危害性评价具有重要意义。但以往研究主要集中在食物中含量较高的杂环胺，如，IQ、PhIP等，有关AαC的基因毒性研究较少；已有研究表明一些杂环胺的基因毒性与其代谢活化和其诱导的氧化应激有关，而AαC诱导的氧化应激作用及其与基因毒性的关系并不清楚。本研究以人肝癌细胞（HepG2）和人肺泡上皮细胞（A549）作为模型，评估了AαC的基因毒性，并对氧化应激在基因毒性机制中的作用进行了研究，分析了AαC主要羟基化代谢产物，并探讨了AαC羟基代谢活化对AαC诱导的氧化DNA损伤的影响。论文内容主要包括以下三部分：
　　一、以HepG2和 A549细胞为模型，研究了AαC的基因毒性及氧化应激在其机制中的作用。实验组用不同浓度的AαC对HepG2和 A549细胞染毒（HepG2细胞染毒剂量为5、10、15、20μg/ml，A549细胞染毒剂量为5、10、20、30μg/ml），对照组用0.1％DMSO进行染毒，采用凝胶电泳(SCGE)试验检测了细胞DNA损伤情况，对AαC的遗传毒性进行了评价。以2’，7’–二氢二氯荧光素(DCFH)荧光探针法测定细胞内活性氧（ROS）水平；用 GSH/GSSG比率测定试剂盒测定GSH/GSSG比率，评估了 AαC诱导的氧化应激效应；通过液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）测定8-羟脱氧鸟苷(8-OHdG)的水平，评估了DNA氧化损伤。结果表明： AαC作用细胞后，与未处理细胞相比，HepG2和 A549细胞 DNA断裂的尾长，尾部DNA含量，Olive尾距显著增高，并且细胞内8-OHdG水平的表达增强(P<0.05或0.01)；细胞内ROS水平比未处理细胞明显增加（P﹤0.05或P﹤0.01）；细胞内GSH/GSSG比率则明显降低（P﹤0.05或P﹤0.01）。结果暗示，AαC使两种细胞产生了氧化应激效应，并造成细胞DNA氧化损伤；8-OHdG水平与Olive尾距呈正相关（R2=0.746），暗示AαC对两种细胞的基因毒性可能与ROS造成的氧化性DNA损伤有关。
　　二、为了探讨 AαC羟基代谢活化在 AαC基因毒性中的作用，采用HPLC-MS/MS方法检测对AαC在细胞中的羟基化代谢物进行了定性和相对定量分析。结果表明：在HepG2和A549细胞孵育体系中，AαC的羟基化代谢产物均为5种，活化代谢产物1种，为N-OH-AαC，解毒产物4种，为6-OH-AαC、5-OH-AαC、4-OH-AαC、3-OH-AαC。但AαC在HepG2和A549细胞中各代谢产物的比例存在差异，活化代谢产物的比例分别为7.85%和31.54%，HepG2细胞中6-OH-AαC产物比例最高占总代谢产物的70.17%，在A549细胞中4-OH-AαC产物比例最高，占总代谢产物的38.41%，；HepG2细胞中5种代谢产物的量均高于A549细胞，这可能是因为两种细胞的酶活性存在差异。
　　三、为了探讨AαC羟基代谢活化对AαC诱导的氧化DNA损伤的影响，以HepG2细胞为模型，用10和20μg/mL的AαC无血清培养基染毒，为了使系统具有不同的代谢活化能力，每个染毒剂量分别加入浓度为0、0.1、0.2、0.5、1mg/mLS9溶液，用HPLC-MS/MS对细胞羟基化代谢产物及8-OHdG含量进行了分析。结果表明：相同染毒剂量下，随 S9溶液浓度的升高，8-OHdG/106dG升高，细胞内N-OH-AαC增加，且细胞内羟基化代谢物与8-OHdG/106dG呈正相关，N-OH-AαC与8-OHdG/106dG相关系数最大，暗示AαC诱导的细胞DNA氧化损伤与AαC的代谢活化有关。

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第一章 绪论

引言

1.1卷烟烟气中的主要杂环胺

1.2杂环胺诱导基因毒性研究

1.3杂环胺的氧化应激效应诱导基因毒性研究

1.4杂环胺代谢对基因毒性影响

1.5主要研究内容及意义

第二章AαC对HepG2和A549细胞基因毒性和氧化应激关系研究

引言

2.1 实验部分

2.2结果与讨论

2.3本章小结

第三章AαC在HepG2和 A549细胞中的羟基化代谢物

引言

3.1 实验部分

3.2结果与讨论

3.3本章小结

第四章AαC羟基活化代谢物对AαC诱导的氧化DNA损伤的影响

引言

4.1实验部分

4.2结果与讨论

4.3本章小结

全文总结

参考文献

附录

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