水相体系酶法制备溶血磷脂酰乙醇胺及酰基转移机理研究

摘要

溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）是利用磷脂酶 A1酶解磷脂酰乙醇胺（PE）失去一个分子脂肪酸后得到的酶解产物。LPE具有重要的医药应用价值，如抗艾滋病毒和肿瘤，脂质体可以作为药物载体，已经被广泛应用于医药行业。随着研究者对LPE药用功能性认识的增加，高纯度LPE产品的研发与应用也备受关注，这与天然LPE的量少相矛盾，目前尚没有高纯度 LPE。本研究针对制备高纯 LPE过程中存在的转化率低、纯度不高及环保等方面的问题，创建了磷脂酶制取技术和硅胶柱色谱技术相结合的联用技术，同时对其酰基转移机理进行研究。
　　首先建立一种水相体系中磷脂酶A1酶解制备LPE的方法。通过液料比、酶解温度、酶添加量及CaCl2添加量等单因素酶解条件，研究对LPE相对含量的影响。利用正交实验对酶解反应条件进行优化，得出其最佳酶解条件为：液料比10:1、酶解温度为35℃、酶添加量为0.04 mL/g，CaCl2添加量为0.01 g/mL，最后得出LPE的相对含量达到42.0％。
　　其次建立一种LPE的硅胶柱色谱纯化技术。通过对柱层析过程中混合洗脱液比例、上样浓度、上样量以及洗脱液流速等纯化工艺因素对溶血磷脂酰乙醇胺分离纯化效果的影响分析，确定了最佳纯化工艺参数：洗脱液配比为氯仿:甲醇=2:1、上样量为1:40 g/g、上样浓度为30 mg/mL，洗脱液流速为2.5 mL/min，最终LPE的纯度达到99.05%，回收率88.69%。
　　研究LPE过程中的酰基转移机理。首先利用HPLC-ELSD对磷脂酶A1催化酶解PE的全过程进行分析检测，结果证实了酶解过程有酰基转移现象发生；然后利用HPLC-RID对磷脂酶A1、磷脂酶A2分别酶解磷脂酰乙醇胺的全过程进行分析检测，结果表明酶解过程中Sn-2-LPE发生了自动酰基转移，得到了Sn-1-LPE，并未发现Sn-1-LPE有自动酰基转移现象。同时通过单因素实验探讨了溶液的极性、pH值、酶解温度及Sn-2-LPE的浓度等因素对酰基转移的影响。

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第一章 绪论

1.1 本课题的研究意义

1.2 LPE的国内外研究进展

1.3 磷脂酶酶解制取技术

1.4 柱色谱纯化

1.5 本课题的主要研究内容

第二章 无水乙醇萃取联用硅胶柱层析制备高纯磷脂酰乙醇胺

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第三章 正交实验优化酶法制备溶血磷脂酰乙醇胺

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第四章 硅胶柱色谱纯化溶血磷脂酰乙醇胺

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.3 结果与分析

4.4 本章小结

第五章 溶血磷脂酰乙醇胺的酰基转移调控机理

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.3 结果与讨论

5.4 本章小结

第六章 结论与展望

6.1 主要结论

6.2创新点

6.3展望

致谢

参考文献

附录一 攻读硕士学位期间发表论文目录

附录二 攻读硕士学位期间获得的科学技术成果鉴定