羊附红细胞体生物学特性研究及其PCR和ELISA检测方法的建立

摘要

为了研究附红细胞体在体外生长变化的规律,为附红细胞体的体外培养提供依据,在羊附红细胞体感染的血液中分别加入三种抗凝剂,试找出对羊附红细胞体(Eperythrozoon ovis)体外生长影响最大的一种抗凝剂.结果表明,柠檬酸钠溶液能使附红细胞体在体外血液中维持一定的数量.在柠檬酸钠溶液中加入葡萄糖和NaHCO3,研究了营养成分的添加对羊附红细胞体的影响.结果表明,在抗凝剂中添加葡萄糖和NaHCO3能显著地提高附红细胞体的数量.故在其后的试验中,采用添加葡萄糖和NaHCO3的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂.根据附红细胞体在离体后12h内保持增殖活性的特性,血样必须在采后12h内处理.2002年1月~2002年12月,用镜检法对羊附红细胞体病的流行病学进行了调查.对附红细胞体的流行病学调查表明,附红细胞体对羊的感染率有一定的季节性,与吸血昆虫有一定的关系.寒冷季节,附红细胞体的感染率非常低,温暖潮湿的春夏季节,感染率呈上升趋势,在炎热的季节,附红细胞体的感染率非常高,常常达到80％以上.对附红细胞体进行分子水平上的研究始见于20世纪80年代,随着基因工程技术的迅猛发展,对该病的研究也逐渐深入到分子水平上.该试验根据羊附红细胞体的16S rRNA基因参考序列的保守区,设计一对特异性引物(p1/p2),对羊附红细胞体基因组DNA进行了PCR检测,扩增出一段1000多bp的DNA序列,用EcoRI酶切,得到两条500bp以上的条带,与预期结果一致,说明PCR方法扩增出了羊附红细胞体的特异条带.并经交叉性和灵敏性试验证明,该方法特异、灵敏、快速,可从分子水平上对附红细胞体病进行早期快速诊断和流行病学调查,是一种理想的精确检测该病的方法,能及时掌握该病的流行情况并迅速准确地对可疑病例作出诊断,杜绝该病的大规模爆发,对控制该病的大范围流行具有重要意义.附红细胞体病的诊断一直以来都是以镜检法作为标准,然而由于附红细胞体个体很小,镜检法有一定缺陷,并且缺乏特异性,故寻求一种快速、特异的诊断方法就成了当务之急.本试验利用血清学技术,摸索了酶联免疫吸附试验(ELISA)的最佳工作条件.自行采集血液,提纯抗原,用常规方法免疫家兔,制备阳性血清,进行酶联免疫吸附试验,并与镜检法作比较,证明ELISA作为诊断羊附红细胞体病的一种方法具有特异、灵敏、快速、高效的优点.以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体为酶标二抗,最佳工作条件为抗原稀释度64倍、阳性血清稀释度160倍、酶标二抗稀释度1000倍,一抗和二抗的最佳反应时间为1h.对羊附红细胞体的最小检出量为50.30 μ g/ml.与支原体、大肠杆菌、葡萄球菌无交叉反应,证明该方法具有良好的特异性.ELISA方法适合于大规模养殖场对附红细胞体病的调查,从整体水平上把握该病的流行情况,为控制该病的传播提供依据.

目录

文摘

英文文摘

独创性声明和关于论文使用授权的说明

1引言

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

2.2.1羊附红细胞体的生物学特性

2.2.2羊附红细胞体的流行病学调查

2.2.3聚合酶链式反应快速检测羊附红细胞体的研究

2.2.4快速检测羊附红细胞体病ELISA方法的建立

3结果与分析

3.1羊附红细胞体的生物学特性

3.2羊附红细胞体的流行病学调查

3.3聚合酶链式反应快速检测羊附红细胞体的研究

3.4快速检测羊附红细胞体病ELISA方法的建立

4讨论

5结论

参考文献

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