乳糖酶高产菌株分离筛选、发酵产酶及酶学性质的研究

摘要

该论文系统研究了产乳糖酶微生物的分离筛选、发酵工艺和酶学性质,发现:(1)通过产酶菌株的分离筛选,建立了一套快速、准确的乳糖酶高产菌株筛选方法:以ONPG作为产酶指示物,采用0.2ml的离心管为初筛工具;确定了合理、客观的综合考察酶活和实际应用中的主要酶学性质两个方面,以OHA;LHA、LHA/OHA;作用温度及热稳定性、作用pH及pH稳定性多个指标组成的三级复筛方法.提出了一种快速、客观的乳糖酶活力测定程序:引入修正系数OHA/LHA,以ONPG为表观指标,除以修正系数,来代替LHA.这样,既能提高测定速度,又能真实反映乳糖水解能力.最终,采用ONPG作为产酶指示物,从保定新天香乳品公司生产车间附近的土壤中筛得一高产菌株,发酵液中OHA=2.24 U/ml、LHA=1.71 U/ml、OHA/LHA=1.31、最适温度70℃、最适pH4.0、热稳定性好(70℃,10min).经菌落形态观察、分生孢子头显微观察,初步鉴定为黑曲霉,是生产食品酶制剂的安全菌株.将D<,2-26>菌株编号为Aspergillus niger D<,2-26>.(2)发酵工艺优化表明,黑曲霉D<,2-26>菌株产酶优化的培养基为:果胶0.3％、玉米浆2%、豆粕粉1.5%、硝酸铵0.2%、K<,2>HPO<,4> 1%、NP-5 0.3%.优化发酵条件为:接种量为孢子浓度104/ml,发酵培养基的起始pH为5.5,装液量为30/250mL,摇床30℃,140rpm,培养7天.经过发酵工艺优化,黑曲霉D<,2-26>菌株产酶活力可达6.53 U/ml.(3)酶学性质研究发现,D<,2-26>菌株乳糖酶的基本酶学性质为:最适作用温度为70℃,作用温度较宽,70℃处理10min,酶活力基本无损失,属于高温乳糖酶;最适作用pH为4,作用pH较宽(2.5-6.5),酶的pH稳定范围在2.5-7之间;K<'+>、Ca<'2+>、Zn<'2+>、Mg<'2+>、pb<'2+>、EDTA对乳糖酶的水解无抑制或激活作用:Fe<'2+>、Cu<'2+>、Mn<'2+>对水解有不同程度的的激活,其中,Fe<'2+>在低浓度下有较高激活作用,Cu<'2+>、Mn<'2+>在高浓度下激活较明显.

目录

文摘

英文文摘

独创性声明和关于论文使用授权的说明

1引言

1.1本研究的目的和意义

1.2国内外现状与研究进展

1.2.1产乳糖酶的微生物

1.2.2关于诱变育种及产酶优化的研究

1.2.3关于分离、纯化及酶学性质的研究

1.2.4关于酶的固定化及酶在生产上的应用

1.2.5关于酶的分子生物学及工程菌

1.3主要内容和总体目标

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1分离源

2.1.2试验菌种

2.1.3主要培养基

2.1.4主要试剂

2.1.5主要仪器设备

2.2主要试验方法

2.2.1样品资源的采集

2.2.2产酶菌株的分离及初筛

2.2.3高产菌株的三级复筛

2.2.4乳糖酶活力的测定程序

3结果与分析

3.1乳糖酶高产菌株的分离、筛选及鉴定

3.1.1样品来源与产酶菌株的分离结果

3.1.2产酶菌株的初筛

3.1.3产酶菌株的复筛

3.1.4乳糖酶高产菌株的初步鉴定

3.2黑曲霉D2-26发酵产酶条件的优化

3.2.1不同碳源对产酶的影响

3.2.2不同氮源对产酶的影响

3.2.3碳源、氮源的正交实验

3.2.4不同无机盐对产酶的影响

3.2.5不同表面活性剂对产酶的影响

3.2.6接种量对产酶的影响

3.2.7温度对产酶的影响

3.2.8培养基起始pH对产酶的影响

3.2.9装液量对产酶的影响

3.2.10菌丝球直径对发酵产酶的影响及控制

3.2.11黑曲霉D2-26产酶曲线

3.3 D2-26粗酶液的酶学性质

3.3.1温度对酶活性的影响及酶的热稳定性

3.3.2酶的低温保存稳定性

3.3.3pH对酶活力的影响及酶的pH稳定性

3.3.4金属离子对酶活力的影响

4讨论

4.1乳糖酶高产菌株筛选方法的建立

4.1.1两种产酶指示物的比较

4.1.2高效初筛方法的建立及应用效果

4.1.3三级复筛的科学性及复筛方法的建立

4.2乳糖酶合理测定程序的确定

4.2.1乳糖酶不同测定方法的比较

4.2.2乳糖酶合理测定程序的确定

4.3高温乳糖酶研究的建议

4.3.1高温乳糖酶的优点

4.3.2高温乳糖酶的来源

4.3.3开发高温乳糖酶的几点思考

5结论

6参考文献

7在读期间发表的学术论文

8作者简历

9致谢