纤溶酶高产菌株的分离筛选、发酵产酶及酶学性质的研究

摘要

血栓性疾病是目前临床上死亡率最高的疾病，寻找高效、安全的溶血栓药物一直是世界医药行业关注的热点。溶栓疗法是血栓性疾病安全且有效的治疗手段。目前临床使用的溶栓药物主要是纤溶酶原激活剂类，尽管这些药物的疗效肯定，但还存在许多缺陷，而且价格昂贵。因此研制高效、快速、副作用小、价廉的新型溶栓药物的需求迫切。微生物是获得溶栓剂的重要来源。 本文以脱脂奶粉作为初筛底物，以自制纤维蛋白作为复筛底物，从保定某屠宰厂附近的土壤中筛得一高产菌株ZLW-2。在此筛选过程中，建立了一套简便、快速、准确的纤溶酶高产菌株筛选方法。经菌落形态和菌体形态观察、芽孢的电子显微镜观察以及生理生化鉴定，初步鉴定为芽孢杆菌属。通过血平板试验发现菌株ZLW-2没有产生溶血现象，说明此菌株的安全性较高。对其进行菌种传代产酶稳定性试验，结果证明菌株ZLW-2产酶性能稳定，传代10次，酶活力均在165.82U/mL左右。 提出了一种快速、客观的纤溶酶活力测定程序。对于纤溶酶活的测定方法，国内外学者使用最多的是纤维蛋白平板法。纤维蛋白平板法最直接，但周期较长，而且由于制备平板时所用的试剂或尿激酶标准品不同，所得的结果可比性差。本试验采用改进的紫外分光光度法测酶活，提高了测定酶活力的精确性，对提高纤溶酶产生菌的筛选效率有重要意义。 在摇瓶发酵水平上，对芽孢杆菌ZLW-2的发酵产酶条件进行了研究，确定了其最佳培养基成分及最佳培养条件。研究了不同碳源、氮源、磷酸盐、金属离子、表面活性剂等因素对芽孢杆菌ZLW-2产酶的影响，发现可溶性淀粉、蛋白胨、磷酸二氢钠浓度对产酶的影响较大。对可溶性淀粉、蛋白胨、磷酸二氢钠三因素各选取三个水平进行正交试验，确定芽孢杆菌ZLW-2产酶的最佳培养基成分为：可溶性淀粉7.0％、蛋白胨7.0％、磷酸二氢钠1.5％、硫酸镁0.01％、CaCl<,2> 10 μmol/L。通过摇瓶发酵试验，确定其最佳培养条件为：摇床32℃，225 r/min，发酵培养基的起始pH值为8.0，接种量为2％，装液量为40 mL/300 mL，培养52 h。经过发酵工艺优化，芽孢杆菌ZLW-2的产酶活力可达547.95 U/mL，是优化前酶活力的3.13倍。 酶学性质研究发现，芽孢杆菌ZLW-2的基本酶学性质为：最适温度为50℃，70℃保温60 min，酶活力仍有11％。最适pH值为8.0。该酶在偏碱pH 7.0～8.0环境下较稳定。在4℃环境中放置30 d后，酶活力仍有91％；在-20℃冰箱冻藏，30 d酶的残余酶活力仍有83％。金属离子中，pb<'2+>、Mn<'2+>对纤溶酶有轻微抑制；Ca<'2+>、Cu<'2+>、Fe<'2+>对纤溶酶有不同程度的激活。EDTA试验显示，它不是金属蛋白酶。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1本研究的目的和意义

1.1.1血栓性疾病

1.1.2血栓形成与溶解的机制

1.2国内外现状与研究进展

1.2.1溶栓剂的研究进展

1.2.2天然生物资源中溶栓剂的研究进展

1.2.3纤溶活性的测定方法

1.3主要内容和总体目标

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1样品来源

2.1.2主要培养基

2.1.3主要试剂

2.1.4主要仪器设备

2.2主要试验方法

2.2.1样品资源的采集

2.2.2产酶菌株的分离及初筛

2.2.3产酶菌株的复筛

2.2.4分光光度法测定纤溶酶的活性

2.2.5溶血实验

2.2.6菌株的鉴定

2.2.7菌株的产酶稳定性试验

2.2.8菌株生长曲线的测定

2.2.9菌株优化前产酶曲线的测定

2.2.10菌株发酵培养基的优化

2.2.11菌株ZLW-2发酵工艺条件的优化

2.2.12粗酶液的酶学性质

3结果与分析

3.1产酶菌株的筛选

3.1.1产酶菌株的初筛

3.1.2产酶菌株的初次复筛

3.1.3产酶菌株的二次复筛

3.1.4菌株的确定

3.1.5 ZLW-2血平板实验结果

3.1.6菌株的产酶稳定性试验

3.1.7菌株ZLW-2的鉴定

3.2芽孢杆菌ZLW-2的发酵培养基的优化

3.2.1芽孢杆菌ZLW-2的种子生长曲线和种龄的确定

3.2.2优化前产酶曲线的测定

3.2.3不同碳源对产酶的影响

3.2.4不同氮源对产酶的影响

3.2.5磷酸盐对产酶的影响

3.2.6金属离子对产酶的影响

3.2.7不同表面活性剂对产酶的影响

3.2.8纤维蛋白对产酶的影响

3.2.9培养基成分的正交试验

3.3芽孢杆菌ZLW-2发酵条件的优化

3.3.1培养温度对产酶的影响

3.3.2培养基起始pH值对产酶的影响

3.3.3接种量对产酶的影响

3.3.4溶氧量对产酶的影响

3.3.5芽孢杆菌ZLW-2发酵过程曲线

3.4 ZLW-2粗酶液的酶学性质

3.4.1温度对酶活性的影响及酶的热稳定性

3.4.2 pH对酶活力的影响及酶的pH稳定性

3.4.3金属离子对酶活力的影响

4讨论

4.1纤溶酶高产菌株筛选方法的建立

4.2纤溶酶活测定方法

4.3纤溶酶高产菌株的产酶条件优化

4.4纤溶酶酶学性质的初步研究

5结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢