极端草甘膦环境中EPSP合酶基因的克隆及其抗性相关位点的鉴定

摘要

该论文以5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶(5-Enolpyruvylshikimate-3-phosp-hate Syntheses简称EPSP合酶)为研究对象,以克隆新的EPSP合酶和鉴定EPSP合酶基因中草甘膦抗性相关位点为目的来进行研究,以获得拥有自主知识产权的抗性基因.采用免培养技术提取极端草甘膦污染土壤的总DNA,利用Sau3AI酶进行部分消化并与载体连接转入EPSP合酶缺陷型大肠杆菌ER2799感受态细胞中而构建形成土壤总DNA的基因文库.通过EPSP合酶互补实验获得了一株草甘膦耐受菌株ERAM1,检测其耐受草甘膦浓度高达150mM,将该菌株重组质粒的外源插入片段进行测序,结果显示该插入的外源片段总长度为3.6kb,其中含有一个454个氨基酸序列的阅读框架,该基因与美国草甘膦抗性相关的美国专利(专利号6,225,114)涉及Escherichia coli,Salmonella typhimueium,Arabidopsis thaliana,Aeromonas salmonicida,Brassica napus,Aspergillus nidulans的aroA基因核苷酸序列和氨基酸序列几乎没有同源性,与美国专利(专利号6,248,876)所提到Achromobacter sp.LBAA,Agrobacterium sp.CP4,Pseudomonas sp.PG2982,Staphylococcus aureus的aroA基因氨基酸同源性在45％以下,但与Bacillus subtilis的aroA基因氨基酸同源性比较接近(56%).表明我们所克隆的基因是一个结构比较新颖的EPSP合酶基因,并且具有较高的草甘膦抗性.利用来源于已有的高抗草甘膦菌株(草甘膦浓度高达500mM)炭光假单胞菌G2的EPSP合酶基因序列设计引物,直接对未经草甘膦污染的土壤稀释培养的单菌落进行PCR来研究细菌抗草甘膦机理.通过分析PCR扩增结果获得一株能够扩增出1.35kb片段的菌株即L35菌株,草甘膦抗性分析发现该菌株在草甘膦浓度高于350mM时不能生长而G2菌株在该草甘膦浓度下能很好生长,说明L35菌株草甘膦抗性明显低于G2菌株的草甘膦抗性.L35菌株的16s rRNA基因分类结果显示L35和G2为同一属,均为假单胞菌.EPSP合酶基因测序结果显示L35与G2的EPSP合酶基因只有两个碱基的差异,氨基酸也相应地发生了两个碱基的变化即Ser-83和Asp-94,此变化的氨基酸位点不在美国保护专利范围内.对L35进行二级结构预测及高级结构比较发现,发生变化的氨基酸位点恰好位于酶与底物结合部位,但不属于关键部位.证明了的确存在一些菌株其本身就有草甘膦抗性特性,在环境诱导下,EPSP合酶基因发生突变使草甘膦抗性增高.,将ERL1 35、G2和ERAM1三种菌株的EPSP合酶基因的碱基序列和氨基酸序列比较发现,三者的碱基序列的同源率为57.46%,而氨基酸的同源率为42.24%,说明三者EPSP合酶基因具有明显的差异.以上研究发现,影响菌株草甘膦抗性的EPSP合酶基因突变位点位于EPSP合酶的第1、2和3区域,说明此三个区域位于EPSP合酶与底物结合的关键区域.

目录

文摘

英文文摘

独创性声明和关于论文使用授权的说明

缩略词

所用菌株及其特性

1引言

1.1草甘膦特性

1.2草甘膦的作用靶酶--EPSP合酶

1.2.1 EPSP合酶的作用机理及草甘膦对该酶的抑制机理

1.2.2 EPSP合酶及其编码基因研究进展

1.3草甘膦抗性获得途径

1.4 EPSP合酶基因的应用

1.4.1抗草甘膦转基因植物的构建

1.4.2 EPSP合酶基因的拆分转基因作物的安全性

1.5立题依据及研究内容

2 EPSP合酶抗性新基因的克隆

2.1材料

2.1.1菌株和质粒

2.1.2细菌的培养

2.1.3培养基

2.1.4试剂

2.2实验方法

2.2.1土壤总DNA基因组文库的构建

2.2.2筛选草甘膦抗性转化子

2.2.3目的菌株的草甘膦抗性分析

2.2.4目的菌株的EPSP合酶基因的获得

2.2.5测序结果的分析

2.3结果和分析

2.3.1土壤总DNA的获得

2.3.2土壤总DNA的部分酶切片段的获得

2.3.3重组载体文库的构建

2.3.4 ERAM1菌株草甘膦抗性分析

2.3.5 ERAM1菌株插入外源片段序列测定

2.3.6 ERAM1-aroA基因是否为新基因的鉴定

2.4讨论

3 PCR随机突变鉴定EPSP合酶基因中抗性相关位点

3.1材料

3.1.1菌株和质粒

3.1.2培养基

3.2方法

3.2.1质粒DNA的提取—碱裂解法

3.2.2目的基因片段的错误倾向PCR突变扩增—使用毛细管PCR扩增仪

3.2.3重组质粒的构建

3.2.4突变株的筛选及草甘膦抗性分析

3.2.5突变株分子鉴定

3.2.6 EPSP合酶突变基因的序列测定

3.2.7突变基因与野生型基因的比较及分析

3.3结果和分析

3.3.1 PCR扩增产物

3.3.2重组质粒的构建和鉴定

3.3.3突变株的筛选及鉴定

3.3.4序列的测定及比较分析

3.3.5蛋白质二级结构的预测

3.4 讨论

4菌落直接PCR方法坚定EPSP合酶抗性相关位点

4.1材料

4.1.1菌株

4.1.2试剂

4.1.3培养基

4.2方法

4.2.1土壤样品的草甘膦含量的分析

4.2.2目的菌株的获得

4.2.3目的菌株的生理特性的研究

4.2.4目的菌株的EPSP合酶基因的获得

4.2.5目的菌株的分子生物学鉴定—16s rDNA序列的分析

4.2.6 16s rDNA和EPSP合酶基因序列分析

4.3结果

4.3.1土壤样品的草甘膦含量及其理性的分析

4.3.2目的菌株L35的获得

4.3.3 L35菌株和G2菌株的草甘膦抗性分析比较

4.3.4 L35菌株与G2菌株的抗生素抗性分析

4.3.5 pH值对L35和G2菌的生长的影响

4.3.6 L35菌株的16s rDNA的序列测定及结果分析

4.3.7 L35菌株的EPSP合酶基因的序列测定及结果分析

4.3.8 L35菌株EPSP合酶二级结构预测

4.4讨论

5结论

参考文献

附录

附录1：AZ50的碱基和氨基酸序列

附录2：AZ100的碱基和氨基酸序列

附录3：ERL135未突变碱基及氨基酸序列

附录4：G2的EPSP合酶基因碱基和氨基酸序列

附录5：L35的碱基和氨基酸序列

附录6：ERAM1的完整的外源片段的碱基序列

附录7：ERAM1的EPSP合酶的碱基和氨基酸序列

附录8：ERAM1与ERL135中EPSP合酶基因碱基序列比较

附录9：ERAM1与G2中EPSP合酶基因碱基序列比较

附录10.ERAM1、ERL135和G2中EPSP合酶基因碱基序列比较

附录11：ERAM1与ERL135中EPSP合酶基因氨基酸序列比较

附录12：ERAM1与G2中EPSP合酶基因氨基酸序列比较

附录13：ERAM1、ERL135和G2中EPSP合酶基因氨基酸序列比较

附录14：溶液的配置

附录15：培养基的配置

附录16：16SrRNA基因PCR引物

附录17：ERL135全基因的引物设计

附录18：G2菌株EPSP合酶基因的引物

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢