可变盐单胞菌中草甘膦抗性EPSP合酶新基因克隆、大肠杆菌表达及其抗性机制的研究

摘要

从被草甘膦极度污染的土壤中分离到一株极端抗草甘膦菌HTG7.它能在900mmol/L草甘膦的限制性培养基Mops上生长.表型及16S rDNA鉴定其为可变盐单胞菌.从可变盐单胞菌HTG7构建的粘粒基因组文库中克隆到一个完整的基因,能恢复EPSP合酶缺陷型菌株E.coli ER2799在限制性培养基中的生长能力,并能在草甘膦浓度为80mmol/L的Mops液体培养基中良好生长.基因全长1350个碱基对,核苷酸序列与目前已报导的编码EPSP合酶的aroA基因几乎没有任何同源性,氨基酸序列与草甘膦抗性相关的美国专利所涉及的22种微生物EPSP合酶的同源性在46﹪以下.利用生物信息学方法,对编码产物进行亚细胞定位,还对其保守结构域、蛋白水解酶的切割位点、蛋白的二级结构、疏水区及跨膜区进行分析预测,所有结果表明我们所克隆的是一个结构新颖、功能明确并高抗草甘膦的新基因.该基因已在GenBank中注册,登录号为AY573186.新基因与pET-28a(+)构建了N-端带有His·Tag和T7·Tag的融合蛋白表达载体,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),30℃能诱导可溶表达.SDS-PAGE显示表达物分子量为51kD;蛋白通过镍离子螯合柱得到了纯化.Western Blot表明经纯化的蛋白可以与检测试剂盒中的抗体特异结合.酶活实验证明表达产物有EPSP合酶的活性.为了寻找EPSP合酶中某些与草甘瞵抗性相关的位点,利用错误倾向PCR技术,对可变盐单胞菌HTG7的EPSP合酶基因进行随机PCR扩增,通过EPSP合酶缺陷型菌株E. coli ER2799的互补筛选,获得了2个不具有草甘膦抗性的EPSP合酶突变体.对突变前后的EPSP合酶进行比较预测,发现突变前后氨基酸位点肽平面和N原子之间形成的扭转角度存在一定的差别.这些结果表明酶的功能主要由中心骨架决定,而肽平面和N原子之间角度的变化,造成高级结构构象细微的差别,致使草甘膦抗性功能的丢失.

目录

文摘

英文文摘

第一章极端污染环境中草苷膦抗性菌株HTG7的筛选及其特性研究

摘要

引言

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

3讨论

参考文献

第二章可变盐单胞菌HTG7菌株中高抗草甘膦EPSP合酶编码基因的克隆及序列分析

摘要

引言

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

3讨论

参考文献

第三章草甘膦抗性EPSP合酶新基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达、纯化及检测

摘要

引言

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

3讨论

参考文献

第四章错误倾向PCR突变对EPSP合酶新基因草甘膦抗性机制的研究

摘要

引言

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

3讨论

参考文献

文献综述

第一节除草剂污染的微生物资源研究进展

第二节除草剂草甘膦及其作用机制

第三节EPSP合酶及其编码基因的研究进展

第四节抗草苷膦的植物研究

参考文献

结论

致谢

在读期间发表论文、申请专利及获奖情况

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