FTA滤膜用于基因芯片检测肉中常见食源性致病菌的研究

摘要

通过不对称PCR技术和基因芯片技术建立了一种准确、快速和高敏感性的检测肉中常见食源性致病菌的方法。用FTA滤膜从食品样品中直接提取模板DNA。用玻片作基因芯片的固相载体。选择常见的引起食物中毒的15株菌的16SrDNA基因的一个片段作为目的基因。设计这段基因的一对通用引物，下游引物用Cy5标记。对两轮不对称PCR反应体系中退火温度、Mg2+浓度进行了优化，以确定适宜PCR反应体系和PCR扩增程序。第一轮适宜反应体系分别为:5uL的10×PCR buffer，0.5uL的20mmol/L，dNTP，引物F1、R2各luL(25umol/L)，0.5uL的Taq酶(2.5U)，含有基因组DNA模板的滤膜，用去离子水补足到50 uL。循环的条件为:94℃变性5min，从94℃变性30s、58.8℃退火1 min到72℃延伸30s共25个循环，最后72℃延伸5 min。第二轮适宜反应体系为:5uL的10×PCR buffer，0.5uL的20 mmol/L dNTP，引物R2 luL(25umol/L)，0.5uL的Taq酶(25U)，第一轮的PCR产物1.5uL，用去离子水补足到50uL。循环的条件为:94℃变性5 min，从94℃变性30s、55.6℃退火30s到72℃延伸30s共30个循环，最后72℃延伸5min。设计二十五条种属的特异性探针，将它们氨基化修饰并点到玻片上，将不对称PCR的15种扩增产物与制作好的基因芯片杂交，用genepix4对杂交结果进行分析。 结果表明10株食源性致病菌(金黄色葡萄球菌、肉毒梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、宋内氏志贺氏菌、霍乱弧菌、普通变形杆菌、拟态弧菌、单核增生李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、腊样芽孢杆菌)的检测具有高敏感性和特异性；副溶血性弧菌的敏感性相对较低；河流弧菌同副溶血性弧菌存在很弱的错杂交，乙型溶血性链球菌的检测同单核增生李斯特菌和腊样芽孢杆菌存在很弱的错杂交，但是均不影响检测结果。大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌由于同源性非常高，可以通过多重PCR方法检测出来。整个样品的检测过程耗时6h。本方法检测灵敏度是102CFU/mL。 针对在线BLAST的不足，建立了16SrDNA基因核苷酸序列本地数据库，并在此基础上进行寡核苷酸探针的本地BLAST以确保其特异性。通过与在线BLAST比较，本地BLAST在准确性、冗余信息的去除以及使用简便性等方面要优于在线BLAST。 基因芯片相比较其它检测方法有很大的优势，它不仅准确、快速、高效，而且高通量，可广泛应用于食源性致病菌感染的诊断、应对和控制。

目录

文摘

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论文说明：缩略词表

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第一章引言

1食品中致病菌及其常规检测技术

1.1食源性致病菌危害的严重性

1.2部分常见的食源性致病菌

1.3食源性致病菌检测技术应用的现状

1.4上述的检测技术应用的不足

2基因芯片技术及其应用

2.1芯片技术简介

2.2基因芯片技术的技术难点

2.3基因芯片技术在微生物检测中的应用

3本项研究的目的意义、立题依据及研究内容

第二章基因芯片检测肉中常见食源性致病菌方法的建立

1材料与试剂

1.1试验菌种和培养基

1.2主要仪器与设备

1.3主要试剂

2试验方法

2.1鲜肉人工污染

2.2鲜肉样品中模板DNA的提取

2.3不对称PCR的扩增和产物的标记

2.4寡核苷酸探针的设计

2.5基因芯片的前处理和制作

2.6基因芯片的杂交和数据的获得与分析

2.7大肠杆菌和沙门氏菌的多重PCR检测

2.8基因芯片的重复性试验

3结果与分析

3.1 16SrDNA基因片断不对称PCR的扩增

3.2基因芯片检测的敏感性

3.3基因芯片的寡核苷酸探针

3.4杂交标准图谱的建立

3.5大肠杆菌O157：H7和沙门氏菌的多重PCR检测

3.6基因芯片重复性试验结果

第三章生物信息学在基因芯片检测中的应用

1肉中常见食源性致病菌16S rDNA基因序列的同源性比较

1.1相关软件与方法

1.2同源性比对结果

2肉中常见食源性致病菌16SrDNA序列本地数据库的建立及本地BLAST的实现

2.1生物信息学资源及方法

2.2本地BLAST结果

第四章 基因芯片检测肉中常见食源性致病菌方法的应用

1材料与方法

1.1菌种和培养基

1.2试验样品

2试验方法

2.1基因芯片的混菌检测

2.2实际样品的基因芯片检测

3结果与分析

3.1基因芯片的混菌检测结果

3.2实际样品检测结果

第五章讨论

1基因芯片检测肉中常见食源性致病菌的检测方法的建立

1.1引物设计

1.2温度设置

1.3 Mg2+离子浓度选择

1.4基因芯片探针的设计

2生物信息学在基因芯片检测中的应用

2.1肉中常见食源性致病菌16SrDNA基因序列的同源性比较

2.2肉中常见食源性致病菌16SrDNA序列本地数据库的建立及本地BLAST的实现

第六章结论

第七章参考文献

作者简历

致谢

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