影响绵羊卵丘细胞核移植效果主要因素的研究

摘要

体细胞核移植技术对于动物育种、保种和濒危动物保护以及发育生物学等基础理论的研究均有重要意义。 所有的细胞拥有同一套基因组，它们都来源于受精卵，但表型却不相同。这是通过表观遗传机制完成。已经在许多物种中证明，通过体细胞核移植，成功的重编程可使分化的体细胞回到全能状态。尽管多种体细胞核移植动物已经诞生，但核移植效率很低。目前普遍认为核移植动物胚胎基因组表观重编程异常是核移植效率低的主要原因。 本研究主要探讨了化学辅助去核时，秋水仙胺的最佳浓度；二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide；DMSO)和胎牛血清(Fetal Bovine Serum；FBS)对核移植胚胎体外发育的影响，以及DNA甲基转移酶抑制剂——5-氮-2′-脱氧核苷对绵羊卵丘细胞核移植胚胎体外发育的影响。 研究发现用0.5μg/ml秋水仙胺处理绵羊卵母细胞0.5h，可使卵母细胞核区形成胞质突起率最高(P<0.01): 化学激活液中DMSO的含量增加到1％或2％，卵裂率比不添加组提高(P<0.01)，添加1％DMSO组囊胚率最高(P>0.05)； 在有糖的胚胎发育液中添加10％FBS，囊胚率极显著提高(P<0.01)； 体细胞核移植胚胎的甲基化水平高于体内正常受精的胚胎，分化的体细胞的甲基化水平高于精子和卵子。使用DNA甲基化转移酶抑制剂——5-氮-2′-脱氧核苷(5-aza-2'-deoxycytidine；5-aza-dC)处理核供体细胞和核移植重构胚胎，来降低它们的DNA甲基化水平，可能会使核移植重构胚的甲基化水平接近体内正常受精胚胎水平，从而提高核移植效率。用不同浓度(0至0.02μM)5-氮-2-脱氧核苷处理绵羊卵丘细胞，发现0.01μM 5-氮-2′-脱氧核苷处理组囊胚发育率极显著高于其他处理组(P<0.01)；但各组间卵裂率和桑椹胚率差异不显著(P>0.05)； 用不同浓度5-氮-2′-脱氧核苷处理绵羊核移植重构胚胎，发现0.01μM 5-氮-2′-脱氧核苷处理组囊胚发育率极显著高于其他处理组(P<0.01)；但各组间卵裂率和桑椹胚率差异不显著(P>0.05)； 0.0lμM 5氮-2'-脱氧核苷同时处理绵羊供体卵丘细胞及核移植重构胚胎时克隆胚胎的体外发育能力，与0.01 μM 5-氮-2′-脱氧核苷单独处理供体卵丘细胞组和0.01μM 5-氮-2'-脱氧核苷单独处理核移植重构胚胎组相比，没有显著提高(P>0.05)。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

1引言

1.1基本概念

1.1.1克隆

1.1.2核移植

1.2哺乳动物体细胞核移植技术研究概况

1.3核移植的技术程序

1.3.1核移植受体的准备

1.3.2供核细胞的选择与准备

1.3.3供体细胞的注入与融合

1.3.4核移植后卵母细胞的激活

1.3.5胚胎的体外培养

1.4影响核移植成功率的因素及存在的问题

1.4.1卵母细胞来源

1.4.2卵母细胞去核效果

1.4.3供体细胞的来源

1.4.4细胞周期阶段对核移植的影响

1.4.5融合—激活方案

1.4.6重构胚培养

1.5体细胞核移植相关机理的研究

1.5.1 DNA甲基化

1.5.2印记基因：

1.5.3 X染色体失活

1.5.4端粒

1.5.5组蛋白修饰

1.6哺乳动物细胞核移植的意义和应用前景

1.6.1扩大优良畜种或稀有动物的数量

1.6.2生产转基因动物

1.6.3生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法

1.6.4作为辅助生殖手段，使不孕不育患者得到自己的后代

1.6.5基础研究

1.7本研究的目的及主要研究内容

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1试验主要仪器及设备

2.1.2主要试剂

2.1.3主要操作液及配制

2.1.4显微操作用去核针的制备

2.1.5显微操作固定针的制备

2.2试验方法

2.2.1绵羊卵母细胞的获取与体外成熟

2.2.2受体卵母细胞的选取

2.2.3供体卵丘细胞的准备

2.2.4卵母细胞的去核与注核

2.2.5卵母细胞胞质与供体卵丘细胞的融合

2.2.6核移植后卵母细胞的激活

2.2.7核移植胚胎的培养

2.2.8数据统计

3结果与分析

3.1不同浓度秋水仙胺对卵母细胞形成突起的影响

3.2不同浓度DMSO对核移植胚胎发育的影响

3.3 FBS对核移植胚胎发育的影响

3.4不同浓度5-aza-dC培养卵丘细胞对核移植胚胎体外发育的影响

3.5不同浓度5-aza-dC处理重构胚胎对其体外发育能力的影响

3.6 5-aza-dC不同处理组合对核移植胚胎体外发育的影响

4讨论

4.1化学去核——秋水仙胺辅助去核

4.2 DMSO对核移植重构胚发育能力的影响

4.3 FBS对核移植重构胚发育能力的影响

4.4基因组甲基化与5-aza-dC

4.5 5-aza-dC对体细胞的影响

4.6 5-aza-dC对核移植重构胚发育能力的影响

5结论

参考文献

附图

在读期间发表的论文

作者简介

致谢