L-羟脯氨酸单克隆抗体的制备及应用

摘要

中国政府已经禁止将皮革固体废弃物制成的动物水解蛋白添加至牛奶中。因此，必须要对牛奶中可能非法添加的“皮革水解物”进行监控和检测。L-羟脯氨酸(HP)是动物水解蛋白中特有的氨基酸，通过检测牛奶中的L-羟脯氨酸可以判定牛奶中是否添加了动物水解蛋白。
　　 为探索一种能快速有效检测牛奶中L-羟脯氨酸的方法，本研究将L-羟脯氨酸分别用对羟基苯甲醛、乙酰氨基苯磺酰氯和5-氯戊酸进行衍生化，合成了三种半抗原HPH、HP1和HP2。并采用N,N'-羰基二咪唑法将HPH分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)连接制备免疫抗原和包被抗原;采用戊二醛法合成了HP1对应的免疫抗原和包被抗原;采用混合酸酐法合成了HP2对应的免疫抗原和包被抗原。N,N'-羰基二咪唑法合成的免疫原的偶联比为14∶1，包被原偶联比为12∶1;戊二醛法合成的免疫原的偶联比为22∶1，包被原偶联比为15∶1;混合酸酐法合成的免疫原的偶联比为13∶1，包被原偶联比为9∶1。以三种免疫原分别免疫Balb/c小鼠，利用间接ELISA方法评价不同的包被抗原与抗体组合，经过多次试验，表明免疫原HPH-BSA具有较好的免疫特性。选择血清效价最高且对半抗原有明显特异性的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞。运用间接竞争ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株，采用有限稀释法经过多次筛选得到三株阳性杂交瘤细胞株。将其注入小鼠腹腔制备腹水，通过辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化腹水，得到针对半抗原HPH的单克隆抗体。该单克隆抗体对原形L-羟脯氨酸的交叉反应性很低，对D-羟脯氨酸和其他氨基酸无交叉反应性。将牛奶样品用浓硫酸高温加热水解，释放出游离的L-羟脯氨酸，再用对羟基苯甲醛进行衍生化，然后进行ELISA检测。该ELISA方法对HPH的最低检测限为0.08μg/mL，相当于对HP的最低检测限为0.04μg/mL。L-羟脯氨酸在空白牛奶中的添加回收率为88.6％～102.5％，变异系数为4.1％～9.7％。因此，该ELISA法可用于牛奶中L-羟脯氨酸的快速检测，以监控牛奶中是否非法添加了动物皮革蛋白水解物。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略词

1 引言

1．1 L-羟脯氨酸概述

1．1．1 L-羟脯氨酸

1．1．2 皮革水解蛋白

1．2 国内外L-羟脯氨酸残留检测研究研究进展

1．3 酶联免疫吸附法

1．3．1 ELISA的原理

1．3．2 ELISA的特点

1．3．3 ELISA的分类

1．3．4 ELISA的应用

1．3．5 ELISA存在的问题

1．4 研究的目的和意义

2 试验材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 试剂和药品

2．1．2 仪器与设备

2．1．3 溶液的制备

2．1．4 试验动物

2．2 试验方法

2．2．1 L-羟脯氨酸抗原的合成与鉴定

2．2．2 抗血清的制备

2．2．3 杂交瘤细胞株的建立

2．2．4 单克隆抗体的制备及纯化

2．2．5 单克隆抗体的评价

2．2．6 样品提取

2．2．7 添加回收率的测定

3 试验结果

3．1 抗原鉴定

3．1．1 半抗原的鉴定

3．1．2 免疫原及包被原的鉴定

3．2 ELISA检测方法的建立

3．2．1 ELISA方法

3．2．2 抗血清效价

3．2．3 检测方法的可行性

3．2．4 小鼠血清抑制率的比较

3．3 杂交瘤细胞株

3．3．1 杂交瘤细胞株的筛选

3．3．2 腹水效价及抑制的测定

3．4 单克隆抗体的纯化及鉴定

3．4．1 单克隆抗体的纯化

3．4．2 单克隆抗体评价

3．4．3 标准曲线

3．5 添加回收率

3．5．1 空白样品的检测

3．5．2 添加回收率的测定

4 分析与讨论

4．1 半抗原与免疫原

4．2 动物免疫

4．3 杂交瘤细胞筛选和克隆化

4．4 抗体纯化

4．5 酶联免疫吸附法

5 结论

参考文献

攻读学位论文期间发表论文情况

作者简介

致谢