PEG11基因在自然繁殖牛和体细胞核移植牛中印记及DNA甲基化分析

摘要

体细胞核移植技术(somatic cell nuclear transfer，SCNT)，又称体细胞克隆技术，在医疗、农业及畜牧业等诸多领域有重要的应用价值。尽管体细胞核移植已经在多种哺乳动物中获得成功，但克隆效率仍然很低，只有2-5％的成活率，即使是存活下来的克隆动物也多伴有器官发育异常，这些制约了体细胞核移植技术的广泛应用。在体细胞核移植过程中，体细胞核放弃已有的高度分化的体细胞模式，进行重编程形成全能性的胚胎模式，此过程称为表观重编程。目前认为，供体核的不完全重编程导致在发育过程中有重要作用的基因异常表达或没有表达是克隆效率低下的主要原因。基因组印记是由表观修饰导致的基因表达具有亲本特异性，而DNA甲基化是调控基因组印记的一种主要表观修饰方式。我们选择在胚胎和胚盘发育中有重要作用的DLK1-D1O3印记域的PEG11印记基因进行研究。
　　 通过PCR-SSCP方法在PEG11基因894nt位置找到一个SNP位点(A/G)，用于等位基因特异基因表达和DNA甲基化状态分析。结果发现，在自然繁殖牛的心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪7个组织中均表达，并且表现为单等位基因(G)。为了确定基因内DNA甲基化是否调控基因的印记表达，应用亚硫酸盐方法分析了在该基因内部的54个CG位点的等位基因特异的甲基化状态。结果显示，两条亲本链（A-链和G-链）均表现为高度甲基化(＞96％)，并且链间甲基化水平无显著差异(P＞0.05)，说明所分析位置的甲基化没有参与调控PEG11基因。
　　 分析PEG11基因体细胞核移植牛组织中的表达发现，PEG11基因在心、肝、脾、肾、肌肉和脂肪6个组织中都是单等位基因表达(G)，但是肺脏中发生印记紊乱。我们对表现为双等位基因表达(A/G)的肺脏进行等位基因特异的甲基化状态分析，在体细胞核移植牛中也呈现高甲基化状态，与自然繁殖牛无显著差异(P＞0.05)，且两条链间无显著差异(P＞0.05)，结果进一步证明PEG11基因内部的DNA甲基化没有调控印记基因的表达。尽管DNA甲基化对印记表达没有调控作用，但是PEG11基因双等位基因紊乱表达也可能是造成体细胞核移植牛肺脏发育异常的原因之一。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 引言

1．1 体细胞核移植技术概况

1．1．1 体细胞核移植技术

1．1．2 体细胞核移植存在的问题

1．1．3 体细胞核移植与表观重编程

1．2 基因组印记研究进展

1．2．1 基因组印记及其发现

1．2．2 印记基因的特征

1．3 主要研究方法

1．3．1 DNA甲基化技术

1．3．2 PCR-SSCP技术

1．4 所研究的基因

1．4．1 DLK1-DIO3印记区域研究现状

1．4．2 PEG11基因研究现状

1．5 研究内容及意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2，1．1 获取牛组织样本

2．1．2 实验药品

2．1．3 试剂配制

2．1．4 主要仪器及设备

2．1．5 生物信息学网站和分析软件

2．2 实验方法

2．2．1 牛PEG11基因生物信息学分析

2．2．2 牛待测组织总RNA的提取及检测

2．2．3 反转录合成cDNA

2．2．4 基因组织特异性表达的RT-PCR分析

2．2．5 牛肺脏基因组DNA的提取及检测

2．2．6 牛PEG11基因杂合子个体筛选

2．2．7 牛PEG11基因印记状态分析

2．2．8 PEG11基因等位基因特异的甲基化状态分析

3 结果与分析

3．1 牛PEG11基因生物信息分析

3．2 牛各组织总RNA的检测结果

3．3 基因组织特异性表达的RT-PCR分析

3．4 牛肺脏基因组DNA的检测

3．5 筛选牛PEG11基因杂合子个体

3．6 牛PEG11基因印记状态分析

3．6．1 杂合子个体待检测组织RNA提取及RT-PCR反应

3．6．2 等位基因特异表达分析

3．7 牛PEG11基因甲基化状态分析

3．7．1 CG岛预测

3．7．2 BSP-PCR引物设计

3．7．3 巢式PCR扩增

3．7．4 序列比对

4 讨论

4．1 牛PEG11基因序列生物信息学分析

4．2 牛PEG11基因的组织特异性表达分析

4．3 PEG11基因印记状态及DNA甲基化状态在体细胞核移植牛的重编程

5 结论

参考文献

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致谢