大豆异黄酮代谢产物对秀丽隐杆线虫的抗衰老作用及其机制研究

摘要

本文以秀丽隐杆线虫为研究对象，首次研究二氢黄豆苷原（Dihydrodaidzein，简称DHD）、二氢染料木素（Dihydrogenistein，简称DHG）、去氧甲基安哥拉紫檀素（O-desmethylangolensin，简称O-Dma）、雌马酚（Equol，简称EQ）以及5-羟基-雌马酚（5-Hydroxy-equol，简称5-OH-EQ）对线虫寿命的影响，发现0.2 mmol/L的EQ和5-OH-EQ能显著延长秀丽隐杆线虫平均寿命，相同浓度的DHD和DHG对线虫寿命无显著影响，相同浓度的O-Dma则能显著缩短线虫平均寿命。在供试的5种不同大豆异黄酮代谢产物中，产物5-OH-EQ对线虫寿命延长效果最佳。代谢产物5-OH-EQ为100％左旋-5-羟基-雌马酚((-)-5-OH-EQ）。
　　通过测定不同浓度的（0.1mmol/L～1.0mmol/L）(-)-5-OH-EQ对线虫寿命的影响，发现较低浓度的(-)-5-OH-EQ可显著延长线虫寿命，以0.1mmol/L～0.2mmol/L的(-)-5-OH-EQ对线虫抗衰老效果最佳;当浓度高于0.8mmol/L时，(-)-5-OH-EQ反而会导致线虫寿命明显减短。由于浓度为0.1mmol/L的(-)-5-OH-EQ和浓度为0.2mmol/L的(-)-5-OH-EQ在对线虫抗衰老作用上无显著差异，因而选用0.1mmol/L的(-)-5-OH-EQ对延寿机制进行研究。急性热应激和胡桃醌导致的氧化损伤试验结果表明，0.1mmol/L的(-)-5-OH-EQ既能显著增强秀丽隐杆线虫的耐热性，同时又能显著增强线虫的抗氧化能力，说明(-)-5-OH-EQ对线虫的延寿作用可能与增强其对环境胁迫的抵抗能力相关。此外，0.1mmol/L的(-)-5-OH-EQ对秀丽隐杆线虫生殖能力无明显影响，表明(-)-5-OH-EQ对线虫的延寿作用并不是通过生殖和寿命之间的“权衡利弊”机制进行调控的。
　　实时荧光定量PCR结果显示，暴露于0.1mmol/L(-)-5-OH-EQ的线虫，其体内daf-2和tub-1的基因表达量显著下调，表明0.1mmol/L的(-)-5-OH-EQ对线虫的延寿作用可能依赖于Insulin/IGF-1信号转导通路。为进一步证实(-)-5-OH-EQ对线虫的延寿作用是依赖于Insulin/IGF-1信号转导途径，我们分别测定了浓度为0.1mmol/L的(-)-5-OH-EQ对线虫突变株daf-2(e1370)和daf-16(mu86)寿命的影响。研究结果表明，0.1mmol/L的(-)-5-OH-EQ对这两株突变体均无显著延寿作用，表明(-)-5-OH-EQ对线虫的延寿作用确实是通过DAF-2/DAF-16 Insulin/IGF-1途径进行调控的。
　　值得一提的是，实时荧光定量PCR结果显示，daf-16下游一些与衰老相关的应激因子（如skn-1，sod-3和hsp16.2）的表达量与对照组相比显著下调。有报道称只有一些强抗氧化剂（如Vc）可导致与衰老相关的应激因子下调。通过测定大豆异黄酮不同代谢产物体外清除超氧阴离子自由基能力发现，相同浓度下5-OH-EQ的体外清除能力均显著高于其余大豆异黄酮代谢产物。因此，上述与衰老相关基因的显著下调可能与5-OH-EQ的强抗氧化特性直接相关。
　　通过本研究国内外首次发现，大豆异黄酮染料木素代谢产物(-)-5-OH-EQ既可显著延长线虫寿命，同时又能显著增强线虫耐热和抗氧化应激能力;代谢产物(-)-5-OH-EQ延长线虫寿命是通过DAF-2/DAF-16Insulin/IGF-1信号转导途径进行调控。由于Insulin/IGF-1信号转导途径在人体内也发挥着极其重要的调节作用，本研究为日后将(-)-5-OH-EQ开发为人类抗衰老药物提供了重要理论依据。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

1．1 大豆异黄酮的组成及其代谢产物的生理功能

1．1．1 大豆异黄酮的种类及其结构

1．1．2 大豆异黄酮的体内代谢

1．1．3 大豆异黄酮代谢产物的生物学功能

1．2 大豆异黄酮转化菌株的研究现状

1．3 模式生物——秀丽隐杆线虫研究概况

1．3．1 秀丽隐杆线虫概述

1．3．2 秀丽隐杆线虫作为抗衰老模型的优势

1．3．3 秀丽隐杆线虫的寿命延长机制

1．3．4 秀丽隐杆线虫作为模式动物在抗衰老药物方面的研究

1．4 研究意义和创新点

1．4．1 研究意义

1．4．2 研究的创新点

第二章 大豆异黄酮代谢产物的合成与制备

2．1 试验材料

2．1．1 药品和试剂

2．1．2 主要试验仪器与设备

2．2 试验方法

2．2．1 主要培养基及溶液的配制

2．2．2 大豆异黄酮代谢产物的合成与制备

2．2．3 大豆异黄酮代谢产物的体外抗氧化活性

2．2．4 统计学分析

2．3 试验结果

2．3．1 大豆异黄酮代谢产物的合成与制备

2．3．2 大豆异黄酮代谢产物对超氧阴离子的体外清除作用

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 大豆异黄酮代谢产物对秀丽隐杆线虫寿命的影响

3．1 试验材料

3．1．1 菌种和线虫来源

3．1．2 培养基

3．1．3 药品与试剂

3．1．4 主要仪器

3．1．5 培养基、缓冲液及主要溶液配制

3．2 试验方法

3．2．1 线虫的培养

3．2．2 线虫的同步化

3．2．3 线虫的液体培养

3．2．4 试验组培养板的准备

3．2．5 大豆异黄酮代谢产物对秀丽隐杆线虫寿命的影响

3．2．6 统计学方法

3．3 结果与分析

3．3．1 大豆异黄酮代谢产物DHD对秀丽隐杆线虫寿命的影响

3．3．2 大豆异黄酮代谢产物DHG对秀丽隐杆线虫寿命的影响

3．3．3 大豆异黄酮代谢产物雌马酚对秀丽隐杆线虫寿命的影响

3．3．4 大豆异黄酮代谢产物O-Dma对秀丽隐杆线虫寿命的影响

3．3．5 大豆异黄酮代谢产物(-)-5-OH-EQ对秀丽隐杆线虫寿命的影响

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 左旋-5-羟基-雌马酚对秀丽隐杆线虫寿命及抗性的影响

4．1 试验材料

4．1．1 菌种和线虫来源

4．1．2 培养基

4．1．3 药品与试剂

4．1．4 主要仪器

4．1．5 培养基、缓冲液及主要溶液配制

4．2 试验方法

4．2．1 (-)-5-OH-EQ对秀丽隐杆线虫寿命的影响

4．2．2 (-)-5-OH-EQ对秀丽隐杆线虫生殖能力的影响

4．2．3 (-)-5-OH-EQ对秀丽隐杆线虫抵抗外界急性热应激能力的影响

4．2．4 (-)-5-OH-EQ对秀丽隐杆线虫抗氧化损伤能力的影响

4．2．5 统计学方法

4．3 结果与分析

4．3．1 (-)-5-OH-EQ对秀丽隐杆线虫寿命的影响

4．3．2 (-)-5-OH-EQ对秀丽隐杆线虫生殖能力的影响

4．3．3 (-)-5-OH-EQ对秀丽隐杆线虫抵抗外界急性热应激能力的影响

4．3．4 (-)-5-OH-EQ对秀丽隐杆线虫抵抗外界氧化应激能力的影响

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 左旋-5-羟基-雌马酚延长线虫寿命的分子机制研究

5．1 试验材料

5．1．1 线虫来源

5．1．2 培养基

5．1．3 药品与试剂

5．1．4 主要仪器

5．1．5 培养基、缓冲液及主要溶液配制

5．2 试验方法

5．2．1 秀丽隐杆线虫的大量培养

5．2．2 提取线虫总RNA

5．2．3 线虫RNA的反转录

5．2．4 Quantitative real-time PCR扩增

5．2．5 大豆异黄酮代谢产物(-)-5-OH-EQ对线虫突变株寿命的影响

5．2．6 统计学方法

5．3 结果与分析

5．3．1 大豆异黄酮代谢产物(-)-5-OH-EQ对线虫体内与寿命相关基因表达量的影响

5．3．2 大豆异黄酮代谢产物(-)-5-OH-EQ对线虫突变株寿命的影响

5．4 讨论

5．5 小结

结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢