章鱼肝脏牛磺酸的提取纯化工艺及黑色素理化性质的研究

摘要

牛磺酸是一种含硫的非蛋白氨基酸，在人体内以游离状态存在，具有多种生理功能，寻找牛磺酸含量高的天然产物替代化学合成法，并探求其最佳提取工艺是当前的研究热点;黑色素是目前已知的唯一能够保护生物体免受辐射伤害的天然内源生物聚合体，具有广阔的应用前景。在章鱼加工过程中，章鱼肝脏和墨囊作为废弃物，其内含有的牛磺酸和黑色素一直被忽视。为了实现章鱼废弃物的高值化利用，本研究以章鱼肝脏和墨囊为原料，首先建立了牛磺酸含量的测定方法并探索了从章鱼肝脏中提取纯化牛磺酸的最佳工艺条件，利用红外和核磁共振光谱对其结构进行了鉴定;对比了两种章鱼墨黑色素的提取方法，并研究了章鱼墨黑色素的理化性质，为章鱼肝脏牛磺酸和黑色素的综合利用提供了试验依据。研究结果如下:
　　(1)建立分光光度法测定章鱼肝脏中牛磺酸含量，其最佳测定条件为:吸收波长413nm，显色剂组成为乙酰丙酮∶甲醛(1.5∶1)，显色剂用量1.0mL，水浴温度为100℃，加热时间20min。在此条件下测得加标回收率为99.4％，其RSD为0.51％，稳定性良好、重现性和精密度试验RSD分别为1.05％、1.39％。
　　(2)以牛磺酸提取得率为指标，采用水煮法从章鱼肝脏中提取牛磺酸，研究了料液比、提取温度、提取时间、自溶时间四个因素对牛磺酸提取得率的影响，并通过正交试验优化了最佳提取工艺。最佳提取条件是:提取温度80℃，料液比1∶4g/mL，自溶时间22h，提取时间40min。在最优工艺条件下章鱼肝脏牛磺酸提取得率为4.65mg/g。
　　(3)采用732 Na+型离子交换树脂分离纯化牛磺酸，最佳工艺条件为:上样pH值4.5，进样量6mL，洗脱速度2mL/min。流出液经HPLC色谱分析为牛磺酸溶液。最佳无水乙醇添加量为三倍体积，4℃结晶，再反复重结晶2～3次，即得纯度达99％以上的天然牛磺酸样品。
　　(4)将提取得到的牛磺酸样品进行红外光谱、核磁共振光谱分析，结果显示:牛磺酸样品红外光谱含有-NH2的吸收峰（3049cm-1，3214cm-1和2969cm-1），S=O的特征峰（1617cm-1）及C-S的吸收峰(1183 cm-1、1215 cm-1、1513 cm-1、1587cm-1)，;核磁共振显示1H-NMR可知δ3.338及δ3.171处两个主要谱峰分别为SCH2质子化NCH2质子化产生。13C-NMR谱图可知，δ47.39归属为C1，δ35.34归属为C2。结果与牛磺酸标准品光谱图比较表明本试验提取的牛磺酸样品为高纯度天然牛磺酸。
　　(5)采用高速离心法和酶法提取章鱼墨黑色素，结果表明高速离心法提取的黑色素在紫外区有230nm，326nm两个特征吸收峰，平均粒径为123nm，结构完好;酶法提取的黑色素在213nm有明显特征吸收峰，在270nm存在弱吸收峰，其平均粒径133nm，结构存在凹陷，综合考虑选用高速离心法作为章鱼墨黑色素的提取方法。
　　(6)章鱼墨黑色素理化性质的分析表明其不溶于大部分有机、无机试剂，在酸性溶液中沉淀，在碱性缓冲液中微溶，在NaOH溶液中溶解性良好;在自然光照条件下该黑色素稳定性较好，在紫外光中不耐受。在长时间高温加热条件下其稳定性较差，并且在不同的pH条件下，随着溶液碱性的增强章鱼墨黑色素的稳定性逐渐升高。

目录

声明

摘要

1．1 研究目的与意义

1．2 章鱼加工副产物的利用现状

1．3 牛磺酸的研究概况

1．3．1 牛磺酸的简介

1．3．2 牛磺酸的生理功能

1．3．3 牛磺酸检测技术的研究进展

1．3．4 牛磺酸提取技术的研究进展

1．3．5 牛磺酸分离纯化的研究进展

1．4 黑色素的研究概况

1．4．1 黑色素的简介

1．4．2 黑色素的理化性质

1．4．3 黑色素的提取纯化

1．4．4 黑色素的功能性

1．5 本研究的主要内容

2．1 试验材料与试剂

2．2 试验仪器与设备

2．3．牛磺酸含量的测定

2．3．1 最佳检测条件的优化

2．3．2 最佳检测条件的验证

2．3．3 标准曲线的绘制

2．4 章鱼肝脏牛磺酸的提取

2．4．1 工艺流程及操作步骤

2．4．2 牛磺酸提取的操作步骤

2．4．3 牛磺酸提取的单因素试验设计

2．4．4 牛磺酸提取的正交试验设计

2．4．5 牛磺酸提取最佳工艺的验证试验

2．5 牛磺酸的离子交换吸附及结构鉴定

2．5．1 牛磺酸树脂交换分离及测定

2．5．2 章鱼肝脏牛磺酸粗提液纯化工艺的研究

2．5．3 牛磺酸流出液的定性分析

2．5．4 结晶条件的选择

2．5．5 牛磺酸结构的鉴定

2．6 章鱼墨黑色素的提取

2．6．1 高速离心法提取

2．6．1 酶解法提取

2．7 章鱼墨黑色素的紫外光谱扫描

2．8 章鱼墨黑色素的SEM图谱及粒径分析

2．9 章鱼墨黑色素的理化性质

2．9．1 溶解性测定

2．9．2 酸碱稳定性测定

2．9．3 对光照的稳定性

2．9．4 对热的稳定性

3．1．1 最佳测定条件的选择

3．1．2 最佳检测条件的验证

3．1．3 牛磺酸标准曲线的绘制

3．2 章鱼肝脏中牛磺酸提取工艺条件的确定

3．2．1 牛磺酸提取的单因素试验结果

3．2．2 牛磺酸提取的正交试验结果

3．2．3 最优工艺条件验证结果

3．3．1 牛磺酸粗提液离子纯化工艺的研究

3．3．2 牛磺酸离子交换流出液的电导率

3．3．3 牛磺酸流出液的HPLC分析

3．3．4 结晶条件的选择

3．3．5 牛磺酸样品结构鉴定

3．4 章鱼墨黑色素的光谱分析

3．4．1 章鱼墨黑色素的紫外-可见吸收光谱

3．4．2 章鱼墨黑色素的SEM图谱分析

3．5 章鱼墨黑色素的理化性质

3．5．1 高速离心法制得的章鱼墨黑色素溶解性

3．5．2 章鱼墨黑色素对酸碱的稳定性

3．5．3 章鱼墨黑色素对光照的稳定性

3．5．4 章鱼墨黑色素对热的稳定性

4 讨论

4．1 章鱼肝脏牛磺酸含量测定方法的研究

4．2 章鱼肝脏中牛磺酸提取工艺的研究

4．3 章鱼肝脏中牛磺酸纯化工艺的研究

4．4 牛磺酸的结构鉴定

4．5 章鱼墨黑色素的提取

4．6 章鱼墨黑色素的理化性质

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

在读期间发表的学术论文及成果

作者简介

致谢