短小芽孢杆菌漆酶重组表达、酶学性质及降解黄曲霉毒素M1的研究

摘要

黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1的羟基化衍生物，主要存在于乳及乳制品中，对肝脏有致畸和致癌作用。我实验室致力于高效绿色的生物降解法消除黄曲霉毒素。为实现黄曲霉毒素M1的生物降解，前期研究中筛选获得了一株具有高效降解能力的短小芽孢杆菌E-1-1-1，其胞外酶能够有效降解黄曲霉毒素M1。 针对胞外酶产量低、难分离、难鉴定的问题，我们对短小芽孢杆菌基因进行分析判断，推测得出CotA漆酶是降解黄曲霉毒素的主要酶。 为验证短小芽孢杆菌E-1-1-1漆酶对黄曲霉毒素的降解能力。本研究以短小芽孢杆菌E-1-1-1 CotA漆酶为研究对象，对其进行基因克隆，异源表达，对重组酶的性质及降解黄曲霉毒素M1能力进行了测定，并以MTT试验测定了黄曲霉毒素M1降解产物的毒性。主要研究结果如下: 1.参照GenBank上公布的短小芽孢杆菌基因序列(UP12_RS03245)设计引物，克隆得到了短小芽孢杆菌E-1-1-1的cotA基因并成功构建表达载体。cotA基因长度为1486 bp，编码495个氨基酸，CotA蛋白相对分子量约为58 kDa，理论等电点为5.94，将克隆得到的cotA基因插入到表达载体pET30a(+)质粒上，构建重组表达载体pET30a-CotA，转化宿主细胞E.coli BL21(DE3)。 2.优化了重组蛋白表达条件。诱导剂使用CuSO4溶液50 mmol/L和IPTG1.0mmol/L诱导温度为22℃、诱导时间为14h，酶活力较优化前提高了2.5倍。纯化后测得重组蛋白分子量约为58 kDa。 3.对重组蛋白的酶学性质进行表征。其最适反应温度为40℃，最适反应pH为4。pH为4的条件下，80℃时CotA漆酶活性半衰期为6h，Km值为3.016、Vmax值为0.7951。SDS、乙醇对CotA有强烈抑制作用;铜离子对其由激活作用;钠离子对其有抑制作用。 4.对重组蛋白的降解能力进行研究。漆酶活力为1U的CotA与鲜奶混合，37℃孵育72 h黄曲霉毒素M1降解率为54.27％。SMMC-7721肝癌细胞MTT试验，400ng/L的黄曲霉毒素M1下细胞存活率加CotA较未加提高了9.02％。 本研究对短小芽孢杆菌E-1-1-1来源的cotA基因克隆表达，并对重组酶的酶学性质进行表征，进一步探究了CotA蛋白在AFM1降解中的潜力，这为生物法降解AFM1提供了新的材料。

目录

声明

摘要

缩略词表

1．1目的意义

1．2国内外研究现状

1．2．1漆酶简介

1．2．2CotA漆酶简介

1．2．3 AFM1研究进展

1．2．4黄曲霉毒素的去除方法

1．2．5黄曲霉毒素的限量标准

1．3存在的主要问题

1．4本研究的主要内容

2．1．1菌种及载体

2．1．2试验试剂

2．1．3培养基及主要溶液的配置

2．1．4仪器与设备

2．2 pET30a-cotA表达载体的构建

2．2．2 cotA基因的获得

2．2．3 PCR产物切胶回收

2．2．4目的片段的克隆

2．2．6 Trans1-T1-cotA转化子的筛选及鉴定

2．2．9 T4噬菌体连接试剂盒连接黏性末端

2．2．10连接产物转化BL21(DE3)感受态细胞

2．2．11基因序列分析

2．3 CotA蛋白表达条件的优化

2．3．3超声破碎菌体制备粗酶液

2．3．4细菌蛋白质抽提试剂盒制备粗酶液

2．4重组蛋白的分离纯化

2．4．1硫酸铵除去杂蛋白

2．4．2超滤管浓缩样品

2．4．3镍柱纯化含His标签蛋白

2．4．4蛋白质含量的测定(Bradfbrd法)

2．5重组CotA漆酶的酶学性质

2．5．3重组CotA漆酶的温度稳定性和pH稳定性测定

2．5．4重组CotA漆酶的动力学常数测定

2．5．5不同变性剂对重组CotA漆酶的影响

2．5．6不同金属离子对重组CotA漆酶的影响

2．6．3SMMC-7721细胞的复苏培养

2．6．5 MTT法测AFM1经重组CotA漆酶处理后对SMMC-7721的细胞毒性

3结果与分析

3．1．2 cotA基因的克隆

3．1．3 cotA基因的序列分析

3．1．4 Bacillus pumilus从来源CotA蛋白的3D模型

3．2 CotA基因的异源表达

3．2．1 pET30a-CotA质粒的构建

3．2．3阳性转化子筛选

3．3重组CotA蛋白的诱导表达

3．3．1诱导温度、诱导时间对CotA蛋白漆酶活性的影响

3．3．2IPTG的加入量

3．4 CotA蛋白的纯化

3．4．1硫酸铵沉淀法

3．4．2镍柱纯化

3．4．3纯化后蛋白含量的测定

3．4．4纯化蛋白的SDS-PAGE电泳

3．5重组CotA蛋白的酶学性质

3．5．1温度、pH对CotA漆酶的影响

3．5．2重组CotA漆酶的动力学常数测定

3．5．3常见金属离子和有机试剂对CotA的影响

3．6 CotA蛋白降解AFM1

3．6．2 牛奶中CotA对AFM1的降解效果

3．7降解产物毒性分析

3．7．2 MTT法测AFM1降解产物对SMMC-7721凋亡的影响

4．1讨论

4．2展望

5结论

参考文献

作者简介

致谢