大豆异黄酮合酶基因的克隆及转基因愈伤组织的制备

摘要

背景
　　 大豆异黄酮是一种植物次生代谢产物，因其在营养、保健和医疗上的重大意义，从而使其成为了国内外研究的热点。自然界中大豆异黄酮的资源十分有限，在大豆中的含量较低，且大豆生长周期长、占用大量耕地面积、产量受自然环境影响大，限制了大豆异黄酮的生产。大豆异黄酮合酶是异黄酮代谢途径的关键酶，转基因技术对于异黄酮的生产具有重要的现实意义。
　　 目的
　　 克隆大豆异黄酮合酶(isoflavone synthase，IFS)基因，并构建双元表达载体，将IFS基因转入大豆愈伤组织中，获得转基因愈伤组织。
　　 方法
　　 选取高异黄酮含量的龙野01-491为材料，以子叶和下胚轴为外植体，以含有30 g/L蔗糖，8 g/L琼脂粉的MS培养基为基本培养基，在不同激素(2，4-D、NAA、6-BA)组合的培养基上诱导愈伤组织。以愈伤组织和大豆种子为材料，超声波辅助提取异黄酮，采用高效液相色谱的方法检测大豆种子和愈伤组织中大豆异黄酮的含量。以高异黄酮含量的下胚轴愈伤组织为材料，提取大豆总RNA，通过RT-PCR的方法克隆大豆IFS基因。将IFS基因正向插入植物双元表达载体pRI101-AN中，构建pRI101-IFS表达载体。运用农杆菌介导的方法将IFS基因转入大豆愈伤组织中，获得转基因愈伤组织。
　　 结果
　　 1.以MS+2，4-D8 mg/L+NAA0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉8 g/L(pH5.8)为培养基，3d即可诱导出黄白色、质地疏松的大豆子叶愈伤组织，培养条件为：25℃，暗培养；以MS+2，4-D0.5 mg/L+NAA1.0 mg/L+6-BA0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉8 g/L(pH5.8)为培养基，6d即可诱导出黄白色、质地疏松的下胚轴愈伤组织，培养条件为：25℃，暗培养。
　　 2.高效液相色谱测定大豆籽粒及愈伤组织中大豆异黄酮的含量，结果显示：龙野及龙品籽粒中异黄酮含量高于普通大豆品种，下胚轴愈伤组织中的异黄酮含量高于子叶愈伤组织。
　　 3.IFS基因植物双元表达载体的构建：pRI101-IFS植物双元表达载体的T-DNA区含有来自于拟南芥的乙醇脱氢酶(ADH)5’端非编码区AtADH5’-UTR，该区域具有增强子的作用，可以在双子叶植物体内高效表达目的基因；还含有来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子作为目的基因在植物中表达的启动子。
　　 4.转IFS基因大豆愈伤组织的制备：pRI101-IFS植物双元表达载体通过农杆菌介导的方法，导入到龙野01-491诱导的愈伤组织中。经过卡那霉素抗性筛选后PCR验证，证明目的基因已经整合到大豆基因组上。
　　 结论
　　 1.在MS+蔗糖30 g/L+NAA1.0 mg/L+2，4-D0.5 mg/L+琼脂粉8 g/L(pH=5.8)的培养基上，25℃暗培养获得高异黄酮含量的愈伤组织。
　　 2.克隆得到的IFS基因与己报道的大豆异黄酮合酶基因(GenBank：AF195798)的核苷酸序列同源性为99％。
　　 3.成功构建含有IFS基因的植物双元表达载体pRI101-IFS，并获得了转基因愈伤组织。