CTGF基因的克隆、真核表达载体的构建及在人胚肾293细胞中的表达

摘要

许多促血管生成因子、血管生成因子和抗血管生成因子参与了糖尿病视网膜病变（Diabetic retinopathy，DR）的发病和进展。结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）作为一种细胞基质调节因子，在细胞的增殖、黏附、迁移以及血管生成、炎症反应和组织重构等生理、病理过程中发挥重要的调节作用。近年来，CTGF与糖尿病及其并发症的关系逐渐受到重视，但CTGF在DR中的作用和机制尚未完全阐明。 目的： 克隆人CTGF基因cDNA，构建重组表达载体pCTGF并转染人胚肾293（HEK293）细胞，检测转染细胞中重组 CTGF基因和蛋白的表达及对细胞增殖的影响，为制备CTGF抗体、进行CTGF表达调控和功能研究奠定实验基础。 方法： 根据GenBank数据库中人CTGF的基因序列，设计特异性引物，以人胚肺成纤维HFL-I细胞cDNA为模板，通过PCR反应扩增CTGF基因并进行测序验证；将序列验证正确的CTGF cDNA基因克隆到真核表达载体pEGFP，将通过双酶切鉴定正确的表达载体命名为p-CTGF并转染HEK293细胞，MTT法检测表达载体对HEK293细胞生长增殖的影响；采用实时荧光定量PCR（qPCR）和Western Blot分别检测转染细胞中CTGF基因mRNA和蛋白的表达水平。 结果： 1.通过PCR扩增及测序验证获得人CTGF基因cDNA序列；双酶切鉴定和测序结果表明成功构建含有CTGF cDNA序列的真核表达载体pCTGF。 2. qPCR和Western Blot实验结果表明，转染pCTGF真核表达载体的HEK293细胞中CTGFmRNA和蛋白水平明显增加。 3.与正常HEK293对照细胞相比，转染pCTGF载体的细胞增殖显著增加（P＜0.05）。 结论： 1.克隆获得人CTGF基因cDNA序列并成功构建真核表达载体pCTGF。 2.转染真核表达载体pCTGF的HEK293细胞中CTGF基因的mRNA和蛋白表达水平显著升高。 3. CTGF基因的表达升高可促进转染组HEK293细胞的增殖。

目录

第一个书签之前