GFP基因真核表达质粒的构建及其在人胚肾293细胞中的表达

摘要

目的克隆绿色荧光蛋白(GFP)基因并构建真核表达载体,观察其在人胚肾293(下称293细胞)细胞中的表达和分布,为制备自行设计的以λ噬菌体为载体的人类免疫缺陷病毒(HIV)核酸疫苗的阳性对照奠定基础.方法以克隆好的pUC18/GFP为模板,根据Genbank中GFP的核苷酸序列设计引物,并在引物的5′端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性扩增GFP基因.TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含GFP编码基因的真核表达载体,酶切鉴定分析后,将该重组质粒通过脂质体介导,转染293细胞.荧光显微镜观察GFP在细胞内的表达和分布.结果重组质粒经BamHⅠ、 XhoⅠ双酶切成5.4kb与0.7kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1(+)中插入了GFP基因片断,测序结果表明编码框正确,并在293细胞中获得了表达,分布均匀.结论 pcDNA3.1(+)/GFP真核表达载体已成功构建,并可在293细胞中表达.