氧化苦参碱调节胰腺星状细胞株LTC-14中TLR4相关microRNAs发挥抗炎作用初步研究

摘要

背景： 慢性胰腺炎(Chronic pancreatitis,CP)各种病因引起胰腺组织和功能不可逆转的慢性炎症性疾病，发病率有逐年增高的趋势。由于其发病机制迄今为止还未明确，所以目前临床治疗上缺乏有针对性的有效药物。近年研究显示，抑制Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)信号通路的启动可能有助于CP的防治。而microRNAs可以在多个水平调节TLR4信号通路。氧化苦参碱(Oxymatrine,OM)是一种药用生物碱，具有抗炎、抗纤维化等多种药理作用，可抑制TLR4信号通路。 目的： 预测靶向TLR4的microRNAs并验证其是否参与调节TLR4/NF-κB通路；验证目标microRNAs是否通过调节TLR4/NF-κB通路参与炎症反应的调节从而改善纤维化；探讨OM对TLR4/NF-κB通路以及炎症反应的抑制作用是否通过microRNAs实现。 方法： 1)生物信息学预测：利用TargetScan7，miranda预测TLR4相关的microRNAs并查找相关文献/芯片，寻找交集。 2)将胰腺星状细胞(LTC-14细胞株)分为4组，Control组，LPS组，OM+LPS组，OM组。通过实时荧光定量PCR(Quantitative Rea-ltime-PCR,qPCR)来筛选目的microRNAs；利用qPCR、蛋白芯片检测LTC-14细胞内TLR4/NFκB信号通路及炎性因子的变化；并对以上变化进行相关性分析以进一步筛选目的microRNAs。 3)分别通过转染oligo过表达microRNAs0h、24h、48h、72h，于不同时间点通过Western Blot检测TLR4/NF-κB通路的关键节点分子(TLR4、髓样细胞分化因子88(myeloid differentiation factor88,MyD88)、核因子κB的抑制蛋白α(nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor,alpha,IκBα)、核转录因子-kappa B(nuclear factor kappa B,NF-κB))蛋白的表达情况，确定oligo转染的最佳作用时间以及最佳目的microRNA。 4)过表达目的microRNA，利用ELISA试剂盒测定LPS刺激及microRNA过表达对炎性因子和纤维化因子的影响。 结果： LPS刺激激活LTC-14细胞后，microRNA-145-3p、microRNA-152、microRNA-322表达量上升，microRNA-30b-5p、microRNA-384-5p、microRNA-211-5p、microRNA-126表达量下降；OM干预后，microRNA-30b-5p、microRNA-211-5p表达量回升。LPS刺激激活LTC-14细胞后，TLR4/NF-κB通路的关键节点分子(TLR4、MyD88、IκBα、NF-κB)及炎性因子(TNF-α、IFNg、IL-1α、IL-2、IL-6、IL-10、IL-13)mRNA表达水平上升，炎性因子(TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6)分泌量上升；OM干预后炎性因子(TNF-α、IL-1α、IL-2、IL-6)mRNA表达水平回落，炎性因子(TNF-α、IL-6)分泌量下降。在LTC-14细胞内多个microRNAs与TLR4/NF-κB通路的关键节点分子呈负相关。 过表达microRNA-30b-5p、microRNA-211-5p、microRNA-384-5p可以下调LTC-14细胞内TLR4/NF-κB通路的关键节点分子(TLR4、MyD88、NF-κB)蛋白表达，过表达microRNA-30b-5p可以下调LTC-14细胞炎性因子TNF-α和纤维化因子FN、ColⅠ的分泌。 结论： MicroRNA-30b-5p可能通过抑制TLR4/NF-κB通路的表达，从而减弱LTC-14细胞炎症反应、改善纤维化。OM对LTC-14细胞炎症反应、纤维化的调节可能是通过影响microRNA-30b-5p而实现的。

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