利用荧光共振能量转移研究DNA聚合酶作用机理及DNA单碱基突变分析

摘要

DNA聚合酶在DNA复制、重组和碱基切除修复过程中起着重要的作用，脱氧核糖核酸是主要的遗传物质，具有重要的生物功能，在生物体的生命活动中起着重要的作用，因此对酶的作用机理研究以及DNA的检测显得尤为重要。荧光共振能量转移分析方法具有仪器简单、灵敏度高、操作简便等优点，广泛地应用于生物大分子的研究。
　　 本文第二章采用荧光素和阳离子共轭聚合物PFP为能量供受体对DNA聚合酶的作用机理进行了研究。荧光素标记的dGTP，在DNA聚合酶作用下与DNA结合，生成E·DNA·dGTP三元复合物，加入阳离子共轭聚合物后，共轭聚合物与DNA强烈作用，拉近了荧光素与PFP的距离，从而能发生荧光共振能量转移。通过检测DNA聚合酶与不同的DNA作用后的荧光共振能量转移情况，我们发现KlenowⅠ DNA聚合酶与双链DNA作用，而Taq DNA聚合酶与引物-模板链的缺口处作用。
　　 本文第三章采用金纳米粒子和阳离子共轭聚合物PFP为能量供受体对进行DNA单碱基突变检测。首先在金纳米粒子表面包裹壳聚糖，GMP通过5'磷酸根与固定在金纳米粒子上的壳聚糖上的-NH2形成氨基磷酸酯键标记在金纳米粒子表面，在KlenowⅠ DNA聚合酶作用下，碱基G与突变位点处的碱基C互补配对形成氢键，使金纳米粒子与DNA结合在一起，加入PFP后，PFP与DNA静电结合拉近金纳米粒子与PFP的距离，产生荧光共振能量转移，金纳米粒子猝灭PFP的荧光，从而实现了对单碱基突变的检测。该方法不需要荧光标记，且金纳米粒子修饰简单，建立了一种简便快速且价格低廉的DNA突变的检测方法。

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英文文摘

声明

第1章 引言

1.1 DNA聚合酶概述

1.2纳米粒子在DNA分析中的应用

1.2.1纳米粒子概述

1.2.2纳米粒子在DNA分析中的应用

1.3荧光共振能量转移原理及其在分析中的应用

1.3.1荧光共振能量转移原理

1.3.2荧光共振能量转移探针概述

1.3.3荧光共振能量转移在生化分析中的应用

第2章利用PFP荧光共振能量转移研究DNA聚合酶作用机理

2.1 前言

2.2实验部分

2.2.1仪器和试剂

2.2.2实验方法

2.3结果与讨论

2.3.1 Klenow Ⅰ DNA聚合酶与DNA作用光谱图

2.3.2 Taq DNA聚合酶与DNA作用光谱图

2.4结论

第3章利用PFP荧光共振能量转移检测DNA单碱基突变

3.1 前言

3.2实验部分

3.2.1仪器和试剂

3.2.2实验方法

3.3结果与讨论

3.3.1壳聚糖对金纳米粒子吸光度的影响

3.3.2金纳米粒子修饰前后对PFP荧光的影响

3.3.3单碱基突变检测

3.4结论

参考文献

致 谢

攻读学位期间取得的科研成果