食品中罗丹明B免疫快速检测技术的研究及应用

摘要

罗丹明B（Rhodamine B，RB），俗称花粉红，是一种具有鲜桃红色的人工合成的化工染料，具有致癌致突变作用。因具有价格低廉、色泽红艳、稳定性强等特点，常被不法分子用作辣椒粉、辣椒油及腊肠等调味品的染色剂，给人们的健康乃至社会带来了极大的危害，因此研究食品中罗丹明B的检测方法是迫切需要的。然而目前，检测食品中RB方面的文献至今未见报道，虽然RB被列为卫生部首批公布的17种违禁食品添加物质之一，但仍有违规应用。因此研究RB的快速检测与鉴定方法具有重大意义。
　　本文通过采用RB的同系物罗丹明123（Rhodamine123，R123）合成人工抗原，制备针对RB的多克隆抗体，初步建立了检测RB的间接竞争酶联免疫吸附法（ELISA）和胶体金免疫层析分析法，两种方法都具有良好的特异性和灵敏度。利用戊二醛法将R123分别与牛血清白蛋白( bovine serμm albμmin,BSA)和卵清白蛋白( ovalbμmin,OVA)进行偶联，制备出完全免疫抗原R123-BSA和包被抗原R123-OVA。将免疫原R123-BSA与弗氏佐剂等体积混匀后，采用皮下多点免疫3月龄的新西兰大耳白兔，制备RB的多克隆抗血清。多次免疫后，经测定兔子产生的抗血清效价为1：4000，采用硫酸铵盐析沉淀法纯化制得的兔抗血清，得到特异性的RB多克隆抗体。以纯化的抗体为基础，建立了RB的间接竞争酶联免疫吸附法。实验表明，在0.001ng/ml～10000ng/ml范围内，IC50为3.96ng/ml，IC15达到了0.23 ng/ml，对罗丹明6G、苏丹红和胭脂红的交叉反应率分别为55.93％、8.82%和0.51%，表明此方法具有较高的特异性，并对方法的精密度、灵敏度等进行了评价。在样品的实际检测中，分别对枸杞、辣椒、花椒进行了检测，消除了基质影响，样品回收率测定为80.50%-110.50%，并通过高压液相色谱法（HPLC）对所建立的ELISA方法进行了比较和验证，两种方法均呈现出良好的线性关系，相关系数R2为0.9695。结果表明，所建立的间接竞争ELISA方法各项参数均能满足实际检测的需要，适合于食品中RB的免疫快速检测。建立了以胶体金标记抗体为基础的RB免疫快速检测技术，以胶体金作为示踪标记物，以硝酸纤维素膜（NC膜）为固相载体，包被R123-OVA作为检测带，包被羊抗兔IgG作为质控带，通过优化实验条件，开发了渗滤式胶体金免疫快速检测试纸条，并研制出RB标准品浓度比色卡，RB检测范围为0.01 ng/ml~20 ng/ml，其最低检出限为0.5 ng/ml。对实际样品的检测，选取枸杞、辣椒、花椒等为样品，进行了RB的定性测试。通过稀释样品提取液的方法，消除了基质影响和色素干扰，且加标回收率试验良好。该方法操作简单，结果直观，无需特殊设备即可实现现场快速检测，适合于调味品及部分食品中RB的快速定性免疫检测。

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第1章 绪 论

1.1 食品安全问题概述

1.2 罗丹明B概述

1.3 食品中罗丹明B检测技术

1.4 本文研究的目的和意义

第2章 罗丹明123完全抗原合成与鉴定

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果与分析

2.4 本章小结

第3章 罗丹明123抗体的制备与效价测定

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果与分析

3.4 本章小结

第4章 罗丹明B ELISA检测方法的建立与应用

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果与分析

4.4 本章小结

第5章 胶体金标记免疫检测技术的研究与应用

5.1 材料

5.2 方法

5.3 结果与分析

5.4 本章小结

第6章 结论与展望

6.1 结论

6.2 创新点

6.3 展望

参考文献

致谢

攻读学位期间取得的科研成果