发酵醋液中氨基甲酸乙酯免疫快速检测技术研究

摘要

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate,EC)，又称乌拉坦，天然存在于面包、酸牛奶、乳酪、酱油及酒精类饮料等发酵食品中，是发酵过程中不可避免的伴随产物，同时它也是一种多位点致癌物，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等疾病。目前食品中的氨基甲酸乙酯被认为是继黄曲霉毒素之后的又一个重要致癌物，因此研究EC快速简便的检测技术具有重要的现实意义。本文重点研究了氨基甲酸乙酯间接竞争 ELISA检测技术和胶体金免疫层析技术。
　　采用戊二醛法将EC分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)进行偶联，制备出人工抗原EC-BSA和包被抗原EC-OVA。将人工抗原EC-BSA与弗氏完全佐剂(或弗氏不完全佐剂)等量混合，乳化后采用背部皮下脊柱两侧多点注射法，免疫健康的新西兰大耳白兔，获得了含有多克隆抗体EC的免疫血清。制备的血清经纯化后用间接ELISA法测得血清效价为1:2000。建立了EC间接竞争ELISA检测方法，实验表明，在0.001 ng/ml-10000 ng/ml范围内，IC50为7.39ng/ml，IC15为0.04 ng/ml。对氨基甲酸甲酯(MC)的交叉反应率为37.16％，说明制备的抗体具有其特异性。在不同发酵时间的发酵醋液中加入EC标准溶液，采用ELISA法测定,测得发酵时间为20天的发酵醋液中EC浓度为23 ng/ml,平均加标回收率为82.83%。同时用HPLC-FLD法进行比对，测得发酵时间为20天的发酵醋液中EC浓度为27 ug/L,平均加标回收率为85%，说明样品前处理方法可行。结果表明，本实验建立的间接竞争ELISA法实现了EC的快速定量检测。
　　研究了胶体金标记抗体的EC免疫快速检测技术。采用柠檬酸三钠还原法制备出直径约为42 nm的胶体金溶液，将制备的胶体金溶液标记EC抗体，得到金标抗体。将EC-OVA点涂在NC膜上作为T带，合理稀释倍数的羊抗兔二抗点涂在NC膜上作为C带，在T带和C带之间加入一定比例混合的EC标准溶液和纯化后的金标抗体的混合液，让包被原和EC标准溶液竞争金标抗体，以此制备金标试纸条。对实验条件进行优化后测得EC的最低检出限为5.0 ng/ml。该方法检测过程简单，检测时间短，适合于EC定性半定量检测。

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第1章 引 言

1.1 氨基甲酸乙酯的简介

1.2 食品中氨基甲酸乙酯的仪器分析方法

1.3 免疫快速检测技术在食品中的应用

1.4 本文研究的目的和意义

第2章 氨基甲酸乙酯完全抗原的合成

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.3 结果与分析

2.4 本章小结

第3章 氨基甲酸乙酯多抗的制备和效价测定

3.1 试验材料

3.2 试验方法

3.3 结果与分析

3.4 本章小结

第4章 氨基甲酸乙酯ELISA检测技术研究

4.1 试验材料

4.2 试验方法

4.3 结果与分析

4.4 本章小结

第5章 胶体金标记免疫检测技术的研究

5.1 试验材料

5.2 试验方法

5.3 结果与分析

5.4 本章小结

第6章 结论与展望

6.1 结论

6.2 创新点

6.3 展望

参考文献

致谢

攻读学位期间取得的科研成果