活动性肺结核患者外周血中分泌IL-22的淋巴细胞亚群的探讨

摘要

研究背景：IL-22是在2000年报道发现的一种炎性细胞因子，可由多种免疫细胞和组织分泌，对于炎症性疾病和自身免疫性疾病的发生具有重要的调节作用。虽然近年发现的Th17细胞以分泌IL-17和IL-22等细胞因子为特征，参与了多种炎症性疾病和自身免疫病的发生发展,但新近又有报道，以分泌IL-22为主要特征的Th22细胞在机体感染病毒或细菌等病原体后，可以激活其他免疫细胞，并且帮助机体控制炎症对抗感染。本室近期研究工作发现，在结核病（TB）患者外周血中分泌IL-17的γδT细胞亚群的比例升高，但在抗TB感染免疫中的作用并不十分清楚；另外，在TB患者外周血中是否也存在分泌IL-22的γδ T细胞，是否也在抗TB感染免疫中发挥作用以及与γδT17细胞的关系等均有待探讨。
　　目的：检测不同淋巴细胞亚群中 IL-22产生细胞的分布，探讨 TB患者和健康人（HD）外周血中分泌IL-22和IL-17的αβT细胞、γδT细胞、B细胞及NK细胞等淋巴细胞亚群比例的变化，以及结核杆菌（M.tb）耐热抗原（Mtb-HAg）体外活化扩增的γδT（Mtb-AT）分泌 IL-22的情况，以探讨不同淋巴细胞亚群在抗 M.tb感染免疫应答和TB发病机制中的作用。
　　方法：1.采集22例活动性肺结核病人和18例HD外周血，加入佛波醇酯（PMA）和钙离子霉素（Ionomycin）刺激培养2小时后，再加入莫能霉素（Monensin）继续培养4小时，收集细胞，加入荧光标记单抗体进行表面分子和胞内染色，流式细胞仪检测分泌IL-22和分泌IL-17的淋巴细胞亚群的比例。2.采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC），加入Mtb-HAg和rIL-2刺激培养7-10天后，使其成为富含效应性γδ T细胞的Mtb-Hag激活的T细胞（MTb-AT），收集细胞用PMA/Ionomycin和Monensin以及Mtb-HAg和Monensin刺激培养6小时，用流式细胞仪检测分泌IL-22的γδT细胞亚群的比例。3.采用同一个体的全血和PBMC同时用流式细胞术检测细胞因子法检测两种标本中分泌 IL-22的细胞比例。4.采用同一个体的全血和PBMC同时用PMA/Ionomycin刺激培养6小时，收集细胞培养上清用ELISA检测IL-22和IL17的含量；采用ELISA检测TB和HD外周血浆中IL-22和IL-17的含量。5.从HD和TB外周血分离获取PBMC后，用RT-PCR的方法检测IL-22 mRNA的表达。
　　结果：1. IL-22分泌细胞仅占人外周血淋巴细胞的一小部分，TB病人和HD分别为3.16％和2.69%；且主要由CD3+T细胞产生，在TB(n=22)病人和HD(n=18)分别为54.56%和64.10%。
　　2.分泌IL-22的淋巴细胞中，γδT细胞所占的比例在TB病人（6.45%，n=22）明显的高于 HD（2.73%，n=18，P﹤0.05)；其它各淋巴细胞亚群所占比例在 TB病人和HD之间未见差别。
　　3.在CD3 T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、γδT细胞、NK细胞、B细胞中分泌IL-22的细胞比例，在TB患者(n=22)分别为1.24%、1.58%、0.66%、7.37%、4.13%和0.54%；在HD(n=18)分别为1.83%、2.12%、0.67%、1.81%、1.96%和1.09%，分泌IL-22的γδT细胞在TB患者明显高于HD（P﹤0.05）。
　　4.在各T细胞亚群中，均可以检测到共表达IL-22和IL-17的阳性细胞；在TB患者中，IL-22+IL-17-细胞百分比为1.87%，Th17细胞为3.78%；在 HD中， IL-22+IL-17-细胞的百分比为2.10%，Th17细胞为3.65%；Th22细胞和 Th17细胞在HD(n=8)和TB(n=15)两者之间没有差别。
　　5.分泌IL-22的γδT细胞在Mtb-HAg活化扩增的γδT细胞（Mtb-AT）中的比例在TB患者（0.75%，n=3）与HD（1.41%，n=5）之间比较没有差别。
　　6.无论TB患者还是HD，用Mtb-HAg再刺激的Mtb-AT中分泌IL-22的γδT细胞的比例与单加Monensin未刺激组相比均没有差别（对TB，0.19%VS0.40%， n=3；对HD，1.16%VS0.62%，n=5，p>0.05）。
　　7.在全血标本中检测到的分泌IL-22的各T细胞亚群的比例均明显高于在PBMC中的检出比例；全血中分泌IL-22的NK细胞和B细胞比例则明显低于在PBMC中的检出比例。
　　8. ELISA法检测的IL-22和IL-17在全血培养上清中的浓度均明显高于在PBMC培养上清中的浓度；TB患者外周血浆IL-22和IL-17的浓度均明显高于HD。
　　9. TB患者外周血IL-22的mRNA表达明显高于HD。
　　结论：
　　1.人类外周血淋巴细胞中T细胞是分泌IL-22的最主要来源，其中CD4+T细胞又是分泌IL-22的主要来源之一。
　　2. TB患者外周血中分泌IL-22的γδT细胞增多，并且分泌IL-22的γδT细胞比例增高并非与分泌IL-17的γδT细胞比例增高引起有关。
　　3. TB患者外周血中Th17和Th22细胞比例与HD相比没有显著性差异。
　　4. Mtb-HAg可特异性诱导γδT细胞分泌IFN-γ，而不能诱导分泌IL-22。
　　5.在全血标本中检测到的分泌 IL-22的T细胞亚群的比例均明显的高于其在PBMC中的检出比例，在全血标本中检测到的分泌IL-22的NK细胞和B细胞比例则明显低于在PBMC中的检出比例。
　　6. TB患者外周血浆IL-22和IL-17的浓度均明显高于HD。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

前言

材 料 和 方 法

1.实验材料

2.实验方法

3. 统计学处理

结果

1．活动性肺结核病人外周血中分泌IL-22的淋巴细胞亚群的检测

2．活动性肺结核病人外周血中共分泌IL-22和IL-17的T淋巴细胞亚群的检测

3. Mtb-HAg对诱导γδT细胞分泌IL-22的抗原非特异性

4. 全血标本和PBMC标本在检测IL-22分泌细胞中的差别

5. ELISA检测分泌到细胞外的IL-22和IL-17的浓度

6. RT-PCR检测TB和HD外周血IL-22的mRNA的表达

讨论

结论

参考文献

附录A英文缩略词表

附录B常用试剂配制

附录C 综述:Th22细胞的研究进展