贵州优质高产茯苓菌株分离纯化筛选及应用研究

摘要

真菌茯苓(Wolfiporia cocos(Schwein．)Ryvarden et Gilbn．)的干燥菌核，是我国珍贵的传统中药材。茯苓的药用价值和营养价值极高，保健作用独特，经济价值可观，应用前景广阔。 本试验对采自贵州的10个野生茯苓菌核和3个人工栽培茯苓菌核进行组织分离，对所得分离菌株进行菌丝形态及荧光核染色显微观察；筛选适合其生长的最适母种、原种培养基。以13个茯苓野生及人工栽培菌核分离株、中国微生物菌种保管委员会收录菌株(6株)以及国内主栽品种(4株)作为试验对象，对其进行菌丝生长初筛、原种培养复筛，筛选出黎13、台17、剑19、剑20号4个优质高产菌株，这4个菌株在野外栽培生产试验中发菌情况良好，采收后测定菌核总重/蔸、结苓个数/蔸、最大个苓重、单蔸最高产量等产量指标，结果发现各项指标均优于对照中5号菌株，结苓率为100％，4株菌株个苓形状规则，肉质纯白，无砂苓，无跑苓现象，结实程度(比重)较好，具有结苓性能好、产量高、质量好等特点。对上述4个优质高产菌株进行遗传特性鉴定，结果显示其遗传稳定。在上述试验基础上建立优质高产菌株筛选模型，为今后茯苓菌株选优及生产研究等提供现实依据。 测定供试菌株在木屑培养基上的生长速率及其向木屑培养基中分泌的CMC酶活力，并对两者进行相关性分析，相关系数为0.951977，表明两者间具有一定的相关性。但测定滤纸酶活力为阴性。 本试验利用RAPD技术对23株供试菌株进行引物筛选，从41条引物中筛选了17条对供试菌株扩增重复性好、谱带清晰，具有一定多态性的引物，进而对10株外来菌株和贵州道地茯苓菌核分离株进行遗传分析和鉴定，通过数据分析建立无根树，探讨其亲缘关系。RAPD分析结果显示不同来源的茯苓菌株亲缘关系非常相近，但在某些引物的扩增物上存在较小的差异，所得聚类结果与23株菌株形态特征的鉴定结果基本一致。这表明采用RAPD技术对茯苓菌株的聚类分析有助于这些菌株亲缘关系及同源性的研究，可为道地茯苓的检测、鉴定提供分子生物学依据。 通过比较两种保藏方法、不同保藏时间茯苓菌种的菌落形态、菌丝体生物量及其液体培养基和固体培养基上的生长规律，发现甘油菌种保藏法和斜面菌种保藏法对茯苓菌种的保藏效果均较理想。

目录

声明

摘要

前言

1.概述

2.国内外研究进展

2.1.茯苓的种质资源

2.2.茯苓的菌种选育

2.3.茯苓的生产技术

2.4.茯苓研究与生产中存在的主要问题及解决办法

3.研究的目的和意义

材料与方法

1.材料

1.1.试验材料

1.2.培养基

1.3.用具、试剂及设备

1.4.染色液

2.试验方法

2.1.茯苓菌核组织分离

2.2.茯苓菌丝形态显微观察及荧光核染色观察

2.3.茯苓菌丝生长培养基配方正交筛选

2.4.优良菌株初步筛选

2.5.原种培养基粗筛

2.6.优良菌株复筛

2.7.茯苓野外栽培试验

2.8.茯苓基因组DNA的RAPD分析

2.9.优良菌株遗传稳定性分析

2.10.菌种保藏

结果与分析

1.茯苓菌核组织分离

2.茯苓菌丝形态观察及荧光核染色观察

3.茯苓菌丝生长培养基配方正交筛选

4.优良菌株初步筛选

4.1.菌株的生长情况

4.2.菌株培养性状

5.原种培养基粗筛

6.优良菌株复筛

6.1供试菌株在原种培养基上生长速度比较

6.2.茯苓菌株在木屑培养基中长速及CMC酶活力差异

6.3.茯苓菌株滤纸酶（C1）活力性测定结果

7.茯苓野外栽培试验

7.1.优质栽培种特征

7.2.各菌株生长情况

7.3.产量与质量

8.RAPD分析

8.1.RAPD引物筛选

8.2.RAPD扩增结果

8.3.RAPD结果数据分析

9.优良菌株遗传稳定性分析

10.菌种保藏

10.1.6个月保藏效果比较

10.2.12个月保藏效果比较

讨论

1.优质高产菌株的筛选与筛选模型的建立

2.RAPD分析

3.茯苓菌种保藏

致 谢

参考文献

发表文章和参加学术交流情况

攻读硕士学位期间参加的研究项目

图 版