南方水稻黑条矮缩病毒基因序列特征及基质蛋白与病毒防控药剂相互作用研究

摘要

南方水稻黑条矮缩病毒(southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)第二组一个新成员。南方水稻黑条矮缩病毒引起的新水稻矮缩病近年在越南北部和我国南方各省爆发，给我国水稻生产带来严重损失。寻找用于防控SRBSDV药剂筛选的候选靶标，建立基于SRBSDV靶标蛋白的SRBSDV防控药剂筛选模型，筛选出具有更高活性的抗SRBSDV小分子化合物可为防治SRBSDV提供新的技术措施。本研究首先采用荧光定量PCR方法，对南方水稻黑条矮缩病毒的13个基因在水稻寄主中的丰度趋势进行考察，了解SRBSDV的基因组组成。选取表达量较高的S9、S8以及S10三个基因为候选靶标，利用生物信息学研究了不同分离物基因组序列性质，最终确定丰度最高且保守性最强的SRBSDV-P9-1基质蛋白为研究靶标。结合生物信息学分析P9-1蛋白的氨基酸序列，发现了其氮端保守区、碳端保守区和131~160 aa的高变区。继而纯化获得了野生型(WT-His-P9-1)、碳端截短23个氨基酸(TR-ΔC23-His-P9-1)，氮端截短6个氨基酸(TR-ΔN6-His-P9-1)以及138位定点突变型(MU-138-His-P9-1)的SRBSDV-P9-1靶标蛋白。采用荧光滴定光谱法(fluorescence titration, FT)和微量热泳动技术(microscale thermophoresis, MST)，在离体条件下探究了毒氟磷(dufulin,DFL)与四种蛋白的相互作用，发现DFL与P9-1的结合常数为微摩尔级。同时，进行DFL抑制SRBSDV的作用机制研究，即通过与SRBSDV-P9-1的碳端23个氨基酸结合，抑制病毒基质的形成。建立了基于SRBSDV-P9-1靶标蛋白来筛选新型病毒防控药剂的作用模型。最后，基于建立的SRBSDV-P9-1靶标蛋白作用模型，进行DFL系列衍生物与蛋白的相互作用研究，筛选出结合作用更强的小分子化合物。具体结论如下：
　　(1)SRBSDV基因在水稻体内表达量分析
　　选取不同生长期、不同地区、不同品种及感染病毒状况的SRBSDV水稻作为研究对象，采用荧光定量PCR法，对SRBSDV的13个基因片段的表达量进行分析。研究结果表明：S9-1、S7-1基因呈现高表达量特性及S6基因呈现最低表达量特性，均不受寄主生长期、地域、品种及病毒侵染状态的影响；S8、S2基因呈现稍高的表达量；而其他基因片段如，S1、S3、S4、S5-1、S5-2、S7-2、S9-2及S10则呈现不规律的表达趋势。
　　(2)SRBSDV重要功能基因的生物信息学分析
　　利用分子生物学技术，结合生物信息学分析基因组核苷酸及氨基酸序列特征，明确不同分离物核苷酸序列的分类地位。对病毒基质蛋白P9-1、外壳蛋白P10和核心蛋白P8进行理化性质和功能预测等分析，确认各基因组的核苷酸全长、GC含量、亲水区及疏水区、编码蛋白的信号肽、二级及三级结构等特征；利用Motif、Blast比对，对S8、S9、S10序列进行同源性分析；结合SNP对S8、S9、S10的核苷酸序列进行突变分析，并结合建立的系统进化树，进一步探索病毒的遗传进化趋势。
　　(3) SRBSDV-P9-1基质蛋白的保守结构域及高变结构域分析
　　选择S9基因组为研究对象，利用GeneDoc软件分析SRBSDV及水稻黑条矮缩病毒(rice black streaked dwarf virus, RBSDV)P9-1序列的保守结构域及高变结构域，研究表明：SRBSDV-P9-1与RBSDV-P9-1序列的碳端和氮端具有高度的保守性；同时SRBSDV-P9-1与RBSDV-P9-1序列之间存在一个高变区，即131~160 aa。
　　(4)野生型和突变型SRBSDV-P9-1基质蛋白的表达与纯化
　　基于SRBSDV-P9-1生物信息学研究结果，利用E. coli BL21(DE3) RIL表达菌株，成功表达和纯化了野生型(WT-His-P9-1)及三种突变型基质蛋白(TR-ΔC23-His-P9-1、TR-ΔN6-His-P9-1以及MU-138-His-P9-1)。
　　(5)DFL及宁南霉素(ningnanmycin,NNM)与P9-1基质蛋白相互作用研究
　　利用FT和MST技术研究了小分子化合物DFL、NNM与P9-1基质蛋白的相互作用。研究结果表明：DFL与 WT-His-P9-1的结合力为1×105.061 M?1(FT)、3.26+/-0.46μM(MST)，NNM与WT-His-P9-1的结合力为1×104.244 M?1(FT)、48.40+/-6.04μM(MST)，即DFL与P9-1基质蛋白的结合力明显强于NNM。为了探究DFL与P9-1的结合位点，利用FT和MST技术研究了DFL与TR-ΔC23-His-P9-1、TR-ΔN6-His-P9-1和MU-138-His-P9-1三种突变蛋白之间的结合作用力。研究结果表明：碳端23个氨基酸对于DFL与基质蛋白的结合起到关键作用。在此基础上，构建了基于 WT-His-P9-1、TR-ΔC23-His-P9-1蛋白的防控 SRBSDV活性小分子化合物作用模型。
　　(6)基于SRBSDV-P9-1基质蛋白靶标模型的DFL衍生物的筛选
　　基于构建的靶标蛋白作用模型，采用FT和MST技术手段，考察了DFL衍生物与WT-His-P9-1基质蛋白的结合作用力。研究结果表明，芳杂环噻吩取代的化合物及苯环上没有取代基、苯环引入?F、?Cl、?NO2、?CF3等六个DFL衍生物与WT-His-P9-1靶标蛋白的结合均为强结合，且都具有微摩尔级的结合能力；碳端23个氨基酸依然影响了小分子化合物与P9-1基质蛋白的结合。

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前言

第一章 文献综述

1.1南方水稻黑条矮缩病毒粒子结构及蛋白功能研究

1.2南方水稻黑条矮缩病毒的生物信息学研究

1.3南方水稻黑条矮缩病毒防控药剂的化学生物学研究

第二章 研究总体思路

2.1研究目的意义

2.2研究方案及技术路线

2.3研究内容

第三章 SRBSDV基因在水稻体内表达量分析

3.1实验材料

3.2实验方法和步骤

3.3结果与讨论

3.4小 结

第四章 重要SRBSDV基因的生物信息学分析

4.1实验材料

4.2实验方法和步骤

4.3结果与讨论

4.4小 结

第五章 SRBSDV-P9-1基质蛋白与病毒防控药剂相互作用研究

5.1实验材料

5.2实验方法和步骤

5.3结果与讨论

5.4小 结

第六章 基于SRBSDV-P9-1基质蛋白靶标模型的DFL衍生物的筛选

6.1实验材料

6.2实验方法和步骤

6.3结果与讨论

6.4小 结

第七章 结 论

7.1研究结果

7.2创新点

7.3未来工作展望

参考文献

致谢

附录