南方水稻黑条矮缩病毒P6的体外表达及其与抗病毒化合物的相互作用研究

摘要

南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV）是呼肠孤病毒科，斐济病毒属病毒。SRBSDV形态为球状，共含有10条RNA基因，其中S6编码的非结构蛋白P6被预测为沉默抑制子。病毒的沉默抑制子蛋白在病毒侵染循环过程起着重要作用，病毒沉默抑制子蛋白被广泛用作筛选寄主互作因子的诱饵。在田间，毒氟磷是一种对南方水稻黑条矮缩病防治效果比较好的药剂之一，在一定程度上控制南方水稻黑条矮缩病毒病的大面积暴发。 本研究通过分子克隆和蛋白纯化的方法研究了P6蛋白在体外表达纯化，采用等温滴定量热法和微量热涌动法研究了抗病毒剂毒氟磷与SRBSDV P6蛋白的相互作用。在体外，通过农杆菌介导的方法研究了毒氟磷对SRBSDV P6蛋白在本氏烟草中表达的影响，在体内研究了毒氟磷对SRBSDV P6蛋白在水稻体内表达的影响。实验结果表明：通过对SRBSDV P6蛋白的体外表达成功纯化得到了纯度较高的SRBSDV P6蛋白，利用MST和ITC技术初步研究了毒氟磷与P6有强相互作用，通过活体验证发现随着毒氟磷喷施浓度的提高，SRBSDV P6蛋白的表达量逐渐降低，揭示了毒氟磷的作用机制为通过抑制P6蛋白的表达来控制南方水稻黑条矮缩病毒的致病性。

目录

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前言

第一章 研究综述

1.1 南方水稻黑条矮缩病病症及病毒特征

1.2 病毒基因沉默抑制子蛋白研究

1.3 药物小分子和蛋白质相互作用的研究

1.3.1 微量热涌动技术研究背景

1.3.2 等温滴定量热技术研究进展

1.3.3 农杆菌介导法研究背景

1.4 本章小结

第二章 论文设计及研究路线

2.1 研究的目的意义

2.2 拟解决的主要问题

2.3 研究内容

2.4 技术路线

第三章 实验材料与方法

3.1 实验材料

3.1.1 供试材料

3.1.2 常用试剂及缓冲液配置

3.1.3 主要仪器设备

3.2 实验方法和步骤

3.2.1 pCold-SUMO-P6质粒的构建

3.2.2 pFastBac1-P6-6His质粒的构建

3.2.3 pCold-SUMO-P6重组质粒的转化和鉴定

3.2.4 pFastBac1-P6-6His重组质粒的转化和鉴定

3.2.5SRBSDV P6蛋白原核诱导表达纯化及鉴定

3.2.6SRBSDV P6蛋白真核诱导表达纯化及鉴定

3.3SRBSDV P6蛋白的活性测试

3.3.2 ITC技术研究SRBSDV P6蛋白与SRBSDV P9-1蛋白的体外互作

3.4毒氟磷等抗病毒化合物与SRBSDV P6蛋白相互作用研究

3.4.1 体外研究

3.4.2 体内研究

第四章 结果与讨论

4.1 重组质粒的鉴定

4.1.1 双酶切验证pCold-SUMO-P6重组质粒

4.1.2 pCold-SUMO-P6重组质粒的测序结果

4.1.3 PCR验证pFastBac1-P6-6His重组质粒

4.1.4 pFastBac1-P6-6His重组质粒的测序结果

4.2 SRBSDV P6蛋白表达小试

4.3SRBSDV P6蛋白纯化

4.3.1原核表达SRBSDV P6蛋白纯化

4.3.2 SDS-PAGE鉴定原核表达SRBSDV P6蛋白

4.3.3蛋白质质谱鉴定原核表达SRBSDV P6蛋白

4.3.4 SRBSDV P6蛋白聚集状态分析

4.3.5SDS-PAGE和WB鉴定真核表达SRBSDV P6蛋白

4.4SRBSDV P6蛋白的活性测试

4.4.1 MST技术研究SRBSDV P6和SRBSDV P9-1的体外互作

4.4.2 ITC技术研究SRBSDV P6和SRBSDV P9-1的体外互作

4.5体外研究毒氟磷等抗病毒化合物与SRBSDV P6蛋白相互作用研究

4.5.1 MST技术研究毒氟磷等抗病毒化合物与牛血清蛋白的相互作用

4.5.2MST技术研究毒氟磷等抗病毒化合物与原核表达SRBSDV P6蛋白相互作用

4.5.3MST技术研究毒氟磷等抗病毒化合物与真核表达SRBSDV P6蛋白相互作用

4.5.4 候选化合物选定

4.5.5ITC技术研究毒氟磷与原核表达SRBSDV P6蛋白相互作用

4.5.6ITC技术研究毒氟磷等抗病毒化合物与真核表达SRBSDV P6蛋白相互作用

4.5.7 WB验证化合物对P6蛋白在本氏烟中瞬时表达的影响

4.6体内研究毒氟磷等抗病毒化合物与SRBSDV P6蛋白相互作用研究

4.7 RT-qPCR研究DFL对SRBSDV接种水稻P6基因水平的抑制作用

第五章 结论

5.1 主要结论

5.1.1 SRBSDV P6蛋白的表达纯化

5.1.2抗病毒剂与SRBSDV P6蛋白的相互作用分析

5.1.3活体研究毒氟磷对SRBSDV P6的影响

5.2 本论文的创新之处

5.3 本论文的不足与展望

致谢

参考文献

附录

1 课题来源

2 研究生期间发表论文

3 抗病毒剂的结构式

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