枯草芽孢杆菌产酱香相关功能基因的筛选及初步研究

摘要

为了分离枯草芽孢杆菌产酱香相关基因，以产酱香的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）E20菌株（tester）与不产酱香的枯草芽孢杆菌10075菌株（driver）为材料，采用抑制消减杂交技术（suppression subtracted hybridization，SSH）比较它们在基因组上的差异，成功构建了枯草芽孢杆菌产酱香的差异基因文库。初步获得了77个差异基因片段，对获得的差异基因片段进行测序及生物信息学分析。
　　Blast分析显示，有65条差异基因片段获取了准确的注释，平均相似度98％。在65个序列中，26个是酶，这些酶中有19个酶在KEGG数据库中共发现245个代谢产物。首先，在已发表的文献中，提取了与45个与酱香形成相关的代谢物；其次，通过名字匹配获取其英文名后通过HMDB和KEGG数据库进行转换；最后，使用KEGG信号通路进行关联分析。对这些代谢物分别进行富集分析，找出对应的代谢通路。通过文库测序基因、基因中找到的酶、酶的代谢产物、酶参与的代谢通路、酶的代谢产物参与的代谢通路；已发表文章中找到的酱香相关代谢产物、相关代谢产物对应的代谢通路，相关代谢产物对应的酶以及一些已知的酱香相关基因等信息来构建多层次共同调控网络。结果显示：
　　1、文库测序基因参与的代谢途径有苯丙氨酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、氮代谢、组氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢等；
　　2、文库测序基因的代谢物主要包括大量氨基酸，糖类，乙酸，丁酸，丙酸以及儿茶酚等小分子化合物；
　　3、文库测序基因的代谢物与乙偶姻及alsS的代谢存在一定的相关性；
　　4、文库测序基因的代谢物为美拉德反应提供前体物质及反应条件；
　　本次实验采用抑制性消减杂交技术成功地分离出了与产酱香相关的基因序列，其中某些差异基因片断直接显示了其在产香味物质前体中的潜力，如苯丙氨酰tRNA合成酶的β链（pheT）、DNA旋转酶A亚单位（gyrA）和HTH型转录调控因子yybE（yybE）等，与之相关的核酸片段是菌株能否产酱香的重要原因，虽然这些信息不能作为产酱香菌株的表型差异的直接证据，但构建的产酱香差异基因文库信息，为进一步研究这些基因片断在产酱香芽孢杆菌中所发挥的作用提供了线索，为今后深入研究酱香的形成机制奠定了基础。

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第一章 前言

1.1酱香型白酒

1.2两种重要的研究技术在酱香型白酒研究中的应用

1.3功能基因的研究策略

1.4本研究立题依据及意义

1.5研究内容

1.6技术路线

第二章 产酱香菌株与不产酱香菌株的筛选

2.1 材料

2.2方法

2.3结果

第三章 枯草芽孢杆菌产酱香SSH文库构建

3.1材料

3.2方法

3.3结果与分析

第四章 讨论与结论

4.1讨论

4.2本文主要结论

参考文献

致谢

附 录 Ⅰ

附 录 Ⅱ

附 录 Ⅲ

附 录 Ⅳ