黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶交联酶聚体制备及性质研究

摘要

脂肪酶是一种极具商业价值的丝氨酸水解酶类，可用于食品、医药、化工等行业。但大多数天然脂肪酶都存在稳定性差、易变性失活以及不可回收利用等缺点，这导致脂肪酶的应用受到限制。因此，本研究采用来自于黑曲霉GZUF36的胞外脂肪酶（extracellular lipase from Aspergillus niger GZUF36,ANL）进行交联酶聚集体（Cross-linked enzyme aggregates,CLEAs）制备，以获得酶活力高、稳定性强且可多次回收利用的固定化脂肪酶。此外，通过对黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶交联酶聚集体（CLEAs-ANL）酶学性质、二级结构、形态外貌以及选择性进行研究，为后续该酶在功能性油脂的合成以及工业化大规模应用提供参考依据和理论基础。主要内容和结果如下： （1）当叔丁醇与粗酶液体积为4：1，交联剂添加量为30μl，交联时间为1.5小时，离心转数为6000r/min时为制备CLEAs-ANL的最佳条件。在该条件下，CLEAs-ANL酶活回收率为100.3±1.1%，酶活力可达13.8±0.51u/ml。研究了不同添加剂如BSA、BSA水解产物、油酸、庚烷、Tween-80、以及SDS等对CLEAs-ANL活性的影响，结果显示BSA、BSA水解液，Tween-80都可对CLEAs-ANL活性起到改善作用，CLEAs-ANL酶活回收率分别可提高11.3%、6.5%、4%。而油酸、SDS和正庚烷对CLEAs-ANL活力会产生负面影响，不适合用作CLEAs-ANL制备的添加剂。 （2）通过丙酮沉淀与反胶束萃可对黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶进行部分纯化。电泳结果显示介于31~43之间出现的条带为目标条带。将部分纯化的脂肪酶用于制备CLEAs并研究其酶学性质。结果显示CLEAs-ANL的最适温度为40℃，较游离酶增加了5℃。在最适反应pH方面，游离酶最适反应pH为6.5，而CLEAs-ANL在pH4.0-6.0差异不显著。说明该脂肪酶固定化后表现出较好的耐酸性。CLEAs-ANL不仅在温度稳定性和pH稳定性方面显示出比游离酶更高的稳定性。而且在不同有机溶剂中的耐受性也普遍高于游离酶。在储藏稳定性方面，游离酶和CLEAs-ANL在储藏30天后相对酶活分别为26.3±1.6%和82.5±4.1%。证明该脂肪酶经交联后储藏稳定性得到改善。在操作稳定性方面，CLEAs-ANL在经过8次回收利用以后仍保持34.9%的相对酶活，操作稳定性良好。最后，通过对游离酶和CLEAs-ANL的动力学参数测定，游离酶的Vmax和Km分别15.9和44.35，而CLEAs-ANL的Vmax和Km分别11.95和226，表明该脂肪酶经固定化后底物亲和性和最大反应速度降低。 （3）通过FTIR检测结果显示，CLEAs-ANL的β-折叠和β-转角相对于游离酶分别增加了31.54%和2.88%，而α-螺旋和无规则卷曲分别减少了5.05%和29.32%。这说明该脂肪酶经交联后刚性增强而柔性降低。SEM结果显示CLEAs-ANL表面结构相对于游离酶更紧凑和均匀。且在15;000X放大倍率下可观察到表面有簇状和空穴，表明底物分子与酶催化位点更容易接触，这利于反应的进行。CLEAs-ANL的粒径约在50μm左右。该粒径符合一般CLEAs的粒径范围。最后通过TLC和HPLC进行选择性分析可知，游离酶和CLEAs-ANL在水解反应中都显示sn-1,3位置选择性。说明交联过程不会对CLEAs-ANL在水解反应中的位置选择性产生影响，而通过与ppl的产物对比，游离酶和CLEAs-ANL在水解反应中显示出的sn-1,3位置选择性高于ppl。然而，在甘油解反应中未检测到游离酶甘油解的反应产物，而CLEAs-ANL的甘油解反应产物中不仅有1,3-DAG的生成，还有部分1,2-DAG的存在，说明CLEAs-ANL在甘油解反应中的选择性有所改变，这可能是因为有机溶剂对CLEAs-ANL的选择性产生了影响。

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第一章 绪论

1.1 脂肪酶

1.1.1 脂肪酶的概述

1.1.2 脂肪酶的来源

1.1.3 微生物脂肪酶的底物特异性

1.1.4 黑曲霉CZUF36的介绍

1.1.5 脂肪酶的应用

1.2 脂肪酶的纯化

1.2.1 常见的脂肪酶纯化技术

1.2.2 反胶束萃取

1.3.1 酶固定的优点

1.3.2 无载体固定化的特点

1.4 交联酶聚集体性能改善研究进展

1.4.1 CLEAs粒径的变化与调控

1.4.2 CLEAs活力的改善

1.4.3 增强CLEAs稳定性

1.4.4 CLEAs的研究现状

1.5.1 立题背景及意义

1.5.2 主要研究内容

第二章 黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶交联酶聚集体体系构建及活力改善研究

2.1.1 主要试剂

2.1.2 主要仪器

2.1.3 菌株来源

2.1.4 培养基

2.1.5 主要溶液的配置

2.2 实验方法

2.2.1 黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶发酵液制备

2.2.2 CLEAs-ANL的制备

2.2.3 沉淀剂类型对CLEAs-ANLL制备的影响

2.2.4 沉淀剂浓度对CLEAs-ANL制备的影响

2.2.5 戊二醛用量对CLEAs-ANL制备的影响

2.2.6 交联时间对CLEAs-ANL制备的影响

2.2.7 离心转数对CLEAs-ANL制备的影响

2.2.8 添加剂对CLEAs-ANL的影响

2.2.9 游离脂肪酶和CLEAs-ANL活力测定

2.2.10数据分析

2.3 结果讨论

2.3.1不同沉淀剂类型对CLEAs-ANL制备的影响

2.3.2 沉淀剂用量对CLEAs-ANL集体制备的影响

2.3.3 不同戊二醛浓度对CLEAs-ANL制备的影响

2.3.4 不同交联时间对CLEAs-ANL制备的影响

2.3.5 离心转数对CLEAs-ANL制备的影响

2.3.6 添加剂对CLEAs-ANL的影响

2.4 本章小结

3.1实验材料与设备

3.1.1 主要试剂

3.1.2 主要仪器

3.1.3 菌株来源

3.1.4 培养基

3.1.5 主要溶液的配置

3.2 实验方法

3.2.1 黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶制备

3.2.2 反胶束萃取

3.2.3 浓缩及脱盐

3.2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.2.5 CLEAs-ANL的制备

3.2.6 CLEAs-ANL酶学性质研究

3.2.7数据分析

3.3 结果讨论

3.3.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果

3.3.2 CLEAs-ANL的最适温度研究

3.3.3 CLEAs-ANL的最适pH研究

3.3.4 CLEAs-ANL的温度稳定性研究

3.3.5 CLEAs-ANL的pH稳定性研究

3.3.6 CLEAs-ANL的有机溶剂耐受性研究

3.3.7 CLEAs-ANL操作稳定性研究

3.3.8 CLEAs-ANL的储藏稳定性研究

3.3.9 CLEAs-ANL的动力学研究

3.4 本章小结

第四章 交联酶聚集体结构及选择性分析

4.1.1 主要试剂

4.1.2 主要仪器设备

4.2 实验方法

4.2.1 CLEAs-ANL的制备

4.2.2 CLEAs-ANL二级结构的傅里叶红外光谱（FTIR）分析

4.2.3 CLEAs-ANL微观形貌的扫描电子显微镜（SEM）分析

4.2.4 CLEAs-ANL的选择性分析

4.2.5数据分析

4.3 结果及讨论

4.3.1 CLEAs-ANL的傅立叶红外分析

4.3.2 CLEAs-ANL的扫描电镜分析

4.3.3 CLEAs-ANL的选择性分析

4.4 本章小结

第五章 结论与展望

5.1主要结论

5.2 展望

致谢

参考文献

附录